梁燕 季芝娟 曾宇翔 張翠真 吳晗霖 楊長(zhǎng)登，*

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超級(jí)早稻中早39稻瘟病抗性的系譜分析

梁燕1季芝娟1曾宇翔1張翠真2吳晗霖1楊長(zhǎng)登1，*

(1中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；2長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434023；*通訊聯(lián)系人，E-mail：yangchangdeng@126.com)

【目的】研究常規(guī)超級(jí)早秈稻品種中早39持久高抗稻瘟病的遺傳基礎(chǔ)，【方法】利用田間抗性鑒定、稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)和基因測(cè)序的方法，分析中早39稻瘟病持久抗性的遺傳基礎(chǔ)?！窘Y(jié)果】中早39、金早47和中組3號(hào)對(duì)7個(gè)稻瘟病抗性基因和的分子標(biāo)記均呈陽(yáng)性條帶；且中早39與金早47、中組3號(hào)對(duì)5個(gè)稻瘟病生理小種的抗性表現(xiàn)完全相同。中早39與金早47、中組3號(hào)無(wú)論是表型還是基因型都完全一致；序列分析結(jié)果表明中早39系譜中的供試材料均含有抗病等位基因?！窘Y(jié)論】中早39的抗稻瘟病特性經(jīng)中組3號(hào)，來(lái)源于金早47。含有的地谷與中早39、金早47和中組3號(hào)對(duì)5個(gè)稻瘟病生理小種的表型相同。

分子標(biāo)記；抗性基因；基因測(cè)序；系譜分析

近年來(lái)，隨著社會(huì)發(fā)展，農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步調(diào)整，我國(guó)的糧食安全隱憂突出[1]。常規(guī)早秈稻因其耐儲(chǔ)存、用途廣泛、商品性好等特點(diǎn)，特別是作為工業(yè)用糧的作用大大增加，是我國(guó)糧食安全的重要支撐。2013年中早39被農(nóng)業(yè)部確定為超級(jí)稻品種，因其具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和持久抗稻瘟病的特點(diǎn)，連續(xù)6年(2011－2016)被農(nóng)業(yè)部推薦為超級(jí)稻示范推廣品種[2]，最近幾年一直作為浙江省早稻區(qū)試的對(duì)照材料。2008－2009年浙江省早稻區(qū)域試驗(yàn)中，中早39的稻瘟病抗性為抗或高抗。2013年中早39連創(chuàng)兩項(xiàng)浙江農(nóng)業(yè)水稻高產(chǎn)紀(jì)錄，成為浙江省早稻種植面積最大的品種[3]。中早39作為恢復(fù)系廣泛應(yīng)用于早稻育種中，由中早39配制的兩系雜交秈稻組合株兩優(yōu)39也于2014年通過(guò)了國(guó)家審定。

前期研究中我們采用來(lái)自全國(guó)12個(gè)省市的 146個(gè)菌株對(duì)中早39進(jìn)行了稻瘟病抗譜測(cè)定，結(jié)果表明中早39對(duì)秈型小種的平均抗譜為82.9%，對(duì)粳型小種的平均抗譜為71.2%。中早39對(duì)不同省市的稻瘟病菌株的抗譜不一致，對(duì)浙江、貴州和廣西的菌株抗譜分別為92.9%、93.1%和100%，說(shuō)明中早39在這3個(gè)省份可以作為稻瘟病抗性育種的抗源使用[4, 5]。中早39是由中組3號(hào)和嘉育253雜交選育而成[6]，中組3號(hào)由金早47經(jīng)無(wú)性系變異選育而成；早秈稻品種金早47是金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所用中87-425/陸青早1號(hào)作親本選育而成[6](圖1)，田間表現(xiàn)高抗稻瘟病。追溯中早39的系譜并結(jié)合各品種的田間抗性表現(xiàn)，推測(cè)中早39對(duì)稻瘟病的抗性是經(jīng)由中組3號(hào)來(lái)自金早47，但是缺乏理論依據(jù)。

聚集抗病基因是抗性育種的主要方法。鑒定、定位和克隆廣譜抗稻瘟病基因，對(duì)深入理解水稻廣譜抗病的分子機(jī)制，培育廣譜和持久抗病品種，持續(xù)有效控制稻瘟病具有重要意義[7]。前期研究結(jié)果表明，中早39廣譜持久抗性的基礎(chǔ)是含有抗性等位基因、和。和是水稻葉瘟抗性位點(diǎn)上的5個(gè)抗性等位基因中的兩個(gè)，其中來(lái)自小粒野生稻，抗譜廣；來(lái)自水稻品種BL1，對(duì)日本大多數(shù)稻瘟病菌小種有抗性，對(duì)中國(guó)的菌株ZB13和ZC15也表現(xiàn)抗病反應(yīng)。源自Q61的稻瘟病抗性基因，對(duì)中國(guó)菌株CHL39有較強(qiáng)的葉瘟抗性，Pi36的第590個(gè)氨基酸由絲氨酸取代天冬氨酸；來(lái)源于粳稻羊毛谷，對(duì)秈稻小種表現(xiàn)廣譜高抗；源自秈稻品種地谷的主效抗稻瘟病基因，對(duì)我國(guó)稻瘟病生理小種ZB15表現(xiàn)較高的葉瘟抗性[6]。是單拷貝基因，編碼長(zhǎng)度為825個(gè)氨基酸的跨膜受體蛋白激酶(RLK)，該激酶氨基端含有疏水性信號(hào)肽、β-lectin結(jié)構(gòu)域、PAN域和TM域，羧基端是個(gè)典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(STK)。因含有膜外β-lectin結(jié)構(gòu)屬于新的抗病基因類(lèi)型，其抗感差異是抗病蛋白的第441氨基酸由異亮氨酸(I)突變?yōu)楦胁〉鞍椎募琢虬彼?M)造成的[6,8]；同樣源自秈稻地谷的主效抗稻瘟病基因，對(duì)我國(guó)稻瘟病生理小種Zhong-10-8-14表現(xiàn)較高的抗性水平[6,9]。因此，我們利用這7個(gè)抗性基因，研究中早39的系譜。

本研究利用田間接種鑒定、分子標(biāo)記鑒定、抗性基因測(cè)序、生物信息學(xué)分析等方法，明確中早39中的抗稻瘟病的基因及其來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中早39、嘉育253、中組3號(hào)、金早47、麗江新團(tuán)黑谷、原豐早、CO39、地谷和稻瘟病鑒別品種(特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18和麗江新團(tuán)黑谷)，以及研究中用到的稻瘟病菌株均由中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室育種新技術(shù)課題組提供。浙輻802、嘉育293、湘早秈1號(hào)、青谷矮3號(hào)和陸青早1號(hào)為中國(guó)水稻研究所水稻種質(zhì)資源庫(kù)魏興華研究員提供, 系譜見(jiàn)圖1。其中麗江新團(tuán)黑谷、原豐早和CO39作為稻瘟病鑒定的感病對(duì)照品種。

1.2 分子檢測(cè)

參照Warude等[10]的方法提取水稻全基因組DNA，1%瓊脂糖膠電泳和超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop 2000c, 美國(guó))檢測(cè)其產(chǎn)量和質(zhì)量。25 μL PCR體系和反應(yīng)條件參照Liang等[7]，每對(duì)引物的退火溫度參照表1。用3%瓊脂糖凝膠(含GelRed)電泳分離后，于BIORAD凝膠成像儀下拍照。PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序，每個(gè)PCR獨(dú)立擴(kuò)增，重復(fù)測(cè)序至少3次。

圖1 超級(jí)早稻中早39系譜

Fig. 1. The genealogy of super early rice Zhongzao 39.

DNA序列經(jīng)BioEdit軟件人工校對(duì)和序列拼接。利用在線軟件“GeneScan (http://genes.mit.187edu/ genscan.html)和Fegenesh (http://linux1. softberry. com/berry. phtml? 188 Topic = fgenesh&group = programs & subgroup = gfind)”進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測(cè)。利用在線軟件MultAli(http: //multalin.toulouse.inra.fr/ multalin)進(jìn)行序列比對(duì)[11]。

1.3 接種鑒定

抗病表型鑒定所用的稻瘟病菌株分別采自浙江省(14-754、10-105、12-157、16-754)和江西省(16-161)早秈稻主產(chǎn)區(qū)重發(fā)病區(qū)的稻瘟病病穗。在稻瘟病鑒別品種特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18和麗江新團(tuán)黑谷上鑒定上述5個(gè)稻瘟病生理小種的致病類(lèi)型，除了來(lái)自江西省的16-161屬于ZG類(lèi)群外，其他4個(gè)菌株均屬于ZA和ZB類(lèi)群(表2)。在中國(guó)水稻研究所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行分生孢子分離、培養(yǎng)和接種。分生孢子接種濃度為2×105~5×105個(gè)/mL，添加0.2% 吐溫-20，在水稻分蘗盛期注射接種。一周后調(diào)查發(fā)病情況，依據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(水稻稻瘟病鑒定技術(shù)規(guī)范)記載病情，以發(fā)病最重的稻株作為該品種的抗性級(jí)別，每個(gè)重復(fù)中只要有2 株以上感病即記為感(S)，低于2株記為抗(R)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型鑒定

中早39由中組3號(hào)和嘉育253雜交選育而來(lái)，而中組3號(hào)是金早47經(jīng)無(wú)性系變異選育而成，田間表現(xiàn)具有與金早47一致的稻瘟病抗譜。供試材料接種于2016年8月3日，一周后的田間接種鑒定結(jié)果顯示(表3)，稻瘟病生理小種14-754侵染金早47、中組3號(hào)和中早39，而其他4個(gè)小種10-105、12-157、16-754和16-161則不能侵染這3個(gè)品種。金早47、中組3號(hào)和中早39對(duì)實(shí)驗(yàn)中的5個(gè)生理小種的抗譜一致。系譜分析結(jié)果表明，稻瘟病生理小種14-754對(duì)系譜上游的浙輻802、嘉育293、湘早秈1號(hào)、青谷矮3號(hào)和陸青早1號(hào)表現(xiàn)免疫，從金早47開(kāi)始致病，在中組3號(hào)和中早39發(fā)病。作為中早39親本之一的嘉育253除了對(duì)14-754表現(xiàn)感病外，對(duì)16-754也表現(xiàn)感病，說(shuō)明中早39的抗稻瘟病特性源于中組3號(hào)和金早47。地谷對(duì)這5個(gè)菌株的抗病反應(yīng)與金早47、中組3號(hào)和中早39完全一致(表3)。

表1 稻瘟病抗性基因檢測(cè)和序列分析所用到的引物

“*”用于基因測(cè)序的引物。

“*” indicates the primers for gene sequencing.

表2 鑒別品種對(duì)供試稻瘟病菌株的抗性表現(xiàn)

表3 供試材料的稻瘟病田間抗性表現(xiàn)

2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)

如圖2所示，稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記在浙輻802、青谷矮3號(hào)、陸青早1號(hào)、金早47、中組3號(hào)和中早39中檢測(cè)到陽(yáng)性條帶，而在其他三個(gè)供試材料中沒(méi)有檢測(cè)到目的條帶。、和四個(gè)抗性基因的特異性分子標(biāo)記在9個(gè)供試材料中都檢測(cè)到陽(yáng)性條帶。在嘉育293和嘉育253中未檢測(cè)到陽(yáng)性條帶。在嘉育293和陸青早1號(hào)中未檢測(cè)到陽(yáng)性條帶。值得注意的是，金早47、中組3號(hào)和中早39的基因型完全一致，本研究的抗性基因分子標(biāo)記均能檢測(cè)到陽(yáng)性條帶。

圖2 稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)

Fig. 2. Molecular detection of the blast resistant genes.

Marker－DL2000。1~9分別代表浙輻802、嘉育293、湘早秈1號(hào)、青谷矮3號(hào)、陸早青1號(hào)、金早47、中組3號(hào)、嘉育253和中早39。CK+自上而下分別為-IRBL9-W、-地谷、-地谷、-Kasalath、-IRBLz-Fu、-IRBLb-B和-羊毛谷。CK-均為H2O。

Marker, DL2000. 1, Zhefu 802; 2, Jiayu 293; 3, Xiangzaoxian 1; 4, Qinggu’ai 3; 5, Luqingzao 1; 6, Jinzao 47; 7, Zhongzu 3; 8, Jiayu 253; 9, Zhongzao 39. From top to bottom, CK+ represent-IRBL9-W,-Digu,-Digu,-Kasalath,-IRBLz-Fu,-IRBLb-B and-Yangmaogu, respectively. CK-, H2O.

圖3 氨基酸序列比對(duì)分析

Fig. 3. Alignment analysis of amino acid sequences.

2.3 抗性基因序列分析

中早39和春江糯遺傳群體定位結(jié)果表明，中早39在所在的分子標(biāo)記區(qū)間含有一個(gè)主效抗稻瘟病基因[5]。結(jié)合本研究的表型鑒定結(jié)果，中早39對(duì)5個(gè)稻瘟病生理小種的抗性表現(xiàn)與地谷一致，將的序列作為研究重點(diǎn)。將供試材料中等位基因的序列與其參考序列(：FJ915121)比較[8]，供試材料中共檢測(cè)到5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，氨基酸多態(tài)性頻率為0.00062；檢測(cè)到3個(gè)單倍型，單倍型多態(tài)性頻率為0.556。將DNA序列轉(zhuǎn)換為氨基酸系列，與參考氨基酸序列(PID2：ACR15163.1)相比，供試材料中共檢測(cè)到兩個(gè)非同義突變D95N和H686R。其中，D95N由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，僅在金早47中檢測(cè)到；而H686R出現(xiàn)在所有的供試材料中，由組氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

3 討論

在水稻抗病育種實(shí)踐中，明確抗病親本中抗性基因型可以更有效地應(yīng)用于育種實(shí)踐[12-14]。對(duì)中早39的抗稻瘟病的遺傳背景研究，有助于從分子水平了解抗性基因在中早39中的來(lái)源與分布情況，為水稻稻瘟病抗性育種提供理論支持。

分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明中早39中含有本研究中用到的所有抗性基因位點(diǎn)和，從一個(gè)方面解釋了中早39具有持久和廣譜的稻瘟病抗性的原因。金早47和中組3號(hào)具有與中早39完全一致的基因型。田間接種鑒定的結(jié)果表明金早47、中組3號(hào)和中早39具有相同的抗譜。田間接種鑒定結(jié)果含有和的地谷具有與中組3號(hào)、金早47和中早39完全一致的抗譜，對(duì)稻瘟病生理小種14-754表現(xiàn)感病，對(duì)其他4個(gè)生理小種表現(xiàn)抗病，說(shuō)明14-754可以侵染攜和抗性基因的水稻品種

前期的研究我們?cè)谥性?9中所在的分子標(biāo)記區(qū)間檢測(cè)到一個(gè)主效抗性基因位點(diǎn)(t)[5]，定位于水稻第6染色體上近著絲粒區(qū)域，與RM527和RM3連鎖，遺傳距離分別為3.2 cM和3.4 cM[15]。序列分析表明，中早39中的等位基因與參考序列相比具有一個(gè)非同義突變H686R，且這個(gè)突變普遍存在于所有的供試材料中。Li等[16]在35個(gè)亞洲栽培稻和6個(gè)野生稻中檢測(cè)到三個(gè)非同義突變S321L、I441M和H686R，其中H686R在所有的供試材料中均被檢測(cè)到，說(shuō)明非同義突變H686R是普遍存在的。本研究中，所有的供試材料在第441個(gè)氨基酸均為異亮氨酸(I)，所以均為抗病等位基因。稻瘟病菌14-754使供試材料包括中早39、中組3號(hào)、金早47和地谷的抗病等位基因失去抗性，而浙輻802、嘉育293、湘早秈1號(hào)、青谷矮3號(hào)、陸青早1號(hào)中可能存在其他的抗性基因，對(duì)14-754表現(xiàn)抗病。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可利用稻瘟病生理小種14-754，將這5個(gè)材料中對(duì)14-754的抗性基因?qū)氲街性?9中，以提高其抗譜。

本研究從田間稻瘟病接種鑒定、稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記檢測(cè)和抗性基因測(cè)序分析3個(gè)方面證明，中早39的稻瘟病抗病特性經(jīng)中組3號(hào)，來(lái)源于金早47。通過(guò)分析稻瘟病抗性基因的序列，確定中早39系譜中的供試材料均含有等位基因。

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Genealogical Analysis on Resistance toof Super Early Rice Zhongzao 39

LIANG Yan1, JI Zhijuan1, ZENG Yuxiang1, ZHANG Cuizhen2, WU Hanlin1, YANG Changdeng1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434023, China;*Corresponding author, E-mail: yangchangdeng@126.com)

【Objective】To clarify the genetic basis of the durable resistance toof the super early rice Zhongzao 39,【Method】blast resistance assessment, molecular marker screening and gene sequencing were conducted.【Result】Zhongzao 39, Jinzao 47 and Zhongzu 3 showed positive bands to all the molecular markers for 7 resistant genes,,,,,and; The resistance performance of Zhongzao 39, were fully consistent with Jinzao 47 and Zhongzu 3 to the 5 isolates collected from Zhejiang and Jiangxi Province, China; Molecular sequencing results showed that all the test materials containresistant alleles. 【Conclusion】These results showed that the genetic basis of durable resistance toof Zhongzao 39 was contributed by Jinzao 47 and Zhongzu 3.

molecular marker; resistant gene; gene sequencing; genealogical analysis

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2017)04-0441-06

2016-09-21;

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2014RG001-3)。

修改稿收到日期：2017-03-23。