王軍 朱金燕 陶亞軍 周勇 范方軍 李文奇 王芳權(quán) 仲維功 楊杰,* 梁國華,*

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基于重測序的染色體片段代換系定位水稻抽穗期QTL

王軍1,2朱金燕2陶亞軍1周勇1范方軍2李文奇2王芳權(quán)2仲維功2楊杰2,*梁國華1,*

(1揚(yáng)州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇揚(yáng)州 225009；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/國家水稻改良中心南京分中心, 南京210014;*通訊聯(lián)系人, E-mail:ricegb@yzu.edu.cn)

【目的】水稻的抽穗期是決定水稻產(chǎn)量及其適用性的重要農(nóng)藝性狀之一，是由多基因控制的數(shù)量性狀。染色體片段代換系減少了個體間遺傳背景的干擾，已經(jīng)成為定位和克隆復(fù)雜性狀QTL的重要材料。【方法】本研究以9311為受體，日本晴為供體構(gòu)建的128個重測序的染色體片段代換系群體為試驗(yàn)材料，利用多元回歸，結(jié)合Bin-map圖譜，【結(jié)果】鑒定到6個在南京、揚(yáng)州不同年份間穩(wěn)定表達(dá)的抽穗期QTL，其中，被定位在第2染色體上的759 848 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第2染色體上的45 286 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第3染色體上的147 931 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第5染色體上的213 351 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第5染色體上的442 305 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第8染色體上的538 176 bp區(qū)間內(nèi)?！窘Y(jié)論】本研究為精細(xì)定位并克隆相應(yīng)QTL，進(jìn)而探明抽穗期QTL的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

水稻；染色體片段代換系；重測序；抽穗期

水稻是全世界最重要的糧食作物之一，全球有超過100個國家種植水稻[1]。稻米為全世界人口提供了21%的熱量和15%的蛋白質(zhì)[1-2]，為我國人口提供70%熱量和65%的蛋白質(zhì)[3]，保障水稻產(chǎn)量對全世界尤其對我國糧食安全至關(guān)重要。抽穗期是水稻重要農(nóng)藝性狀之一，抽穗期通過決定營養(yǎng)生長期的長短，影響光合生產(chǎn)和物質(zhì)積累，最終直接或間接地影響水稻的產(chǎn)量。水稻抽穗期受感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性的影響，三者相互作用決定了水稻品種對地域和季節(jié)的適應(yīng)性。水稻抽穗期遺傳基礎(chǔ)較為復(fù)雜，一般認(rèn)為抽穗期是由主效基因和微效多基因共同控制，遺傳方式既有數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，也有質(zhì)量性狀遺傳特性，不同品種表現(xiàn)出不同的遺傳特點(diǎn)，即使同一品種的抽穗期也會由于溫光條件的不同而表現(xiàn)出不同的遺傳方式[4]。

水稻品種的抽穗期長短由其內(nèi)在的遺傳發(fā)育機(jī)制和外在的環(huán)境因素(光照和溫度)共同決定的，這使得水稻抽穗期的遺傳機(jī)制非常復(fù)雜。截至目前，國內(nèi)外的研究者利用F2/F3、BC1、DHs和RILs等傳統(tǒng)群體發(fā)現(xiàn)了618個抽穗期相關(guān)的基因(QTL)，分布于水稻全部12條染色體上，其中，只有20多個抽穗期相關(guān)基因(QTL)被克隆。究其原因是因?yàn)檫@些傳統(tǒng)的定位群體內(nèi)QTL之間存在較復(fù)雜的互作和個體間遺傳背景的干擾，使對QTL的估計不準(zhǔn)確，很難實(shí)現(xiàn)QTL的精細(xì)定位和克隆。染色體單片段代換系是利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)建立起來的一套近等基因系，與其受體親本之間除代換片段存在差異外，其余部分均相同。通過比較染色體片段代換系與其受體親本之間的性狀差異，就可以定位到代換片段上的QTL。染色體片段代換系可以消除群體內(nèi)遺傳背景的干擾，將復(fù)雜性狀分解為簡單性狀，已經(jīng)成為復(fù)雜性狀QTL精細(xì)定位與克隆的最主要群體。在利用染色體片段代換系進(jìn)行抽穗期QTL定位研究方面，Qiao等[5]利用198個9311為受體，普通野生稻為供體的染色體片段代換系定位了3個抽穗期相關(guān)QTL，位于第2和第10染色體上。Shen等[6]利用1套Zhenshan 97為受體，Minghui 63為供體的染色體片段代換系定位了12個抽穗期相關(guān)的QTL，分布在除了第5、10染色體外的其余10條染色體上。王軍等[7]利用廣陸矮4號為受體，日本晴為供體的85個染色體單片段代換系在南京和海南不同溫光條件下共定位到40個抽穗期相關(guān)的QTL，分布于水稻的全部12條染色體上。楊德衛(wèi)等[8]利用9311為受體，日本晴為供體構(gòu)建的94個染色體片段置換系定位了4個控制水稻抽穗期的QTL，分別位于第3、第4、第5和第8染色體。王韻等[9]利用Lemont和特青的雙向回交導(dǎo)入系群體在北京和海南2個環(huán)境下共定位了16個影響抽穗期的QTL，其中6個QTL在2個環(huán)境下都能檢測到。何鳳華等[10]以華粳秈74為受體，6個水稻品種為供體的52個單片段代換系鑒定出20個抽穗期QTL，這些QTL分布于水稻除第5、第6染色體外的10條染色體上。

染色體片段代換系大大提高了QTL定位的精確度，但由于染色體片段代換系構(gòu)建是建立在分子標(biāo)記檢測的基礎(chǔ)上，分子標(biāo)記數(shù)量的有限性、分布的不均勻性及雙交換等問題的存在，可能導(dǎo)致一些小片段漏檢從而使得QTL定位不準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，分別以全基因組測序的秈稻品種9311、粳稻品種日本晴為受體和供體，構(gòu)建了一套染色體單片段代換系群體并借助高通量全基因組重測序的方式對所有染色體片段代換系進(jìn)行了精確的基因型鑒定[11]，所選用的材料遺傳背景清晰，導(dǎo)入片段和背景片段大小已知，可以準(zhǔn)確地用于QTL定位研究。本研究利用這一套重測序的染色體片段代換系，于2012、2016年在揚(yáng)州、南京共定位了6個穩(wěn)定表達(dá)的抽穗期QTL，為進(jìn)一步精細(xì)定位并克隆相應(yīng)的QTL和選育適宜生育期的優(yōu)質(zhì)水稻新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以秈稻品種9311為受體親本，粳稻品種日本晴為供體親本，在回交和自交過程中利用覆蓋水稻全基因組分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，構(gòu)建的128個染色體片段代換系及受體親本9311、供體親本日本晴為試驗(yàn)材料。參考Huang等[12]的方法，通過高通量測序，對128個染色體片段代換系進(jìn)行了重測序，每一個系的代換片段在染色體上的位置及長度都準(zhǔn)確獲知，代換片段在水稻全基因組的覆蓋率為93.3%。

1.2 試驗(yàn)方法

分別于2012年5月5日在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(E1)；2016年5月15日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院部試驗(yàn)田(E2)、5月5日在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(E3) 3個生長環(huán)境種植128個染色體片段代換系群體以及2個親本。分別于6月5日、6月15日、6月5日進(jìn)行移栽，每個系栽4行，每行15株，行、株距分別為26.7 cm和13.3 cm。3個環(huán)境下均種植對照，對照在田間均勻分布，每隔30個染色體片段代換系種植一個輪回親本9311作為對照小區(qū)，間比法順序排列。選取每個小區(qū)的中間2行的10株作為調(diào)查對象。在水稻剛開始抽穗的時候，調(diào)查每一株的最早穗的見穗日期，每天調(diào)查一次。抽穗期為從播種期到抽出第一個穗的天數(shù)。

1.3 QTL分析

Bin-map的制作參考Paran等[13]。對于整個群體而言，代換片段存在重疊區(qū)段，根據(jù)重疊和非重疊的區(qū)段，將供體片段切割并編碼，每一個切割后的小區(qū)段稱為Bin，根據(jù)整個群體的Bin信息繪制覆蓋基因組的Bin-map。根據(jù)128個染色體片段代換系的測序物理圖譜及代換片段的切割信息，繪制了代換片段的Bin-map，總共包括401個Bin，定義為X1～X401。Bin的長度為13 213～10 654 035 bp，平均長度為889 652 bp。QTL分析利用多元回歸分析方法，參考Xu等[11]的方法，結(jié)合Bin-map，每一個Bin作為一個變量，利用方差分析精確估計誤差，提高遺傳分析效率，采用多元回歸實(shí)現(xiàn)QTL的精確定位，回歸模型如下：

y為第系的性狀平均值；0為模型均值；是bin的總數(shù)；b為第個bin的偏回歸系數(shù)；x為第個體第個bin基因型的指示變量，依bin的基因型來源不同而取值，來自供體的bin?。?，來自受體親本的bin取1；e為隨機(jī)誤差。

1.4 QTL效應(yīng)分析

QTL加性效應(yīng)值的計算，參照Eshed等[14]的方法估算各個QTL 的加性效應(yīng)值及加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率。加性效應(yīng)值=(片段代換系的表型值－9311的表型值)/2；加性效應(yīng)百分率=(加性效應(yīng)值/9311的表型值)×100%。QTL的命名依照McCouch等[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及128個染色體片段置換系的抽穗期

128個染色體片段代換系2012年在揚(yáng)州(E1)的抽穗期為82.7～133.6 d(圖1-A)；受體親本9311的抽穗期為(108.0±1.2) d，供體親本日本晴的抽穗期為(97.7±1.3) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)。128個染色體片段代換系2016年在南京(E2)的抽穗期為80.1～122.6 d(圖1-B)；受體親本9311的抽穗期為(99.1±1.5) d，供體親本日本晴的抽穗期為(86.1±1.2) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)。128個染色體片段代換系2016年在揚(yáng)州(E3)的抽穗期為75.2～120.8 d(圖1-C)；受體親本9311的抽穗期為(98.1±1.3) d，供體親本日本晴的抽穗期為(88.6±1.5) d(圖1-D)，親本間抽穗期差異達(dá)到極顯著水平(<0.01)。

A－E1環(huán)境中抽穗期分布; B－E2環(huán)境中抽穗期的分布; C－E3環(huán)境中抽穗期的分布; D－9311日本晴在不同環(huán)境中抽穗期的表型。

Fig. 1. Distribution of heading date in the chromosome segment substitution lines and parents in different environments.

2.2 抽穗期QTL分析

根據(jù)128個染色體片段代換系和9311抽穗期的表型值，結(jié)合Bin的圖譜，基于多元回歸分析方法，共定位到6個在3個環(huán)境中均能被檢測到的QTL(表1)。其中，第2和第5染色體上各有2個；第3和第8染色體上各有1個。被定位在第2染色體上的759 848 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第2染色體上的45 286 bp區(qū)間內(nèi)。這兩個QTL位于相鄰區(qū)間。被定位在第3染色體上的147 931 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第5染色體上的213 351 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第5染色體上的442 305 bp區(qū)間內(nèi)；被定位在第8染色體上的538 176 bp區(qū)間內(nèi)。

2.3 抽穗期QTL效應(yīng)分析

對128個重測序片段進(jìn)行分析，獲得了6個抽穗期QTL中5個抽穗期的單片段代換系。利用這5個染色體單片段代換系對QTL效應(yīng)進(jìn)行分析(表2)。表現(xiàn)為減效作用，在3個環(huán)境中加性效應(yīng)分別為－11.5、－7.2和－10.5 d，加性效應(yīng)百分率分別為－10.7%、－7.3%和－10.7%。表現(xiàn)為減效作用，在3個環(huán)境中加性效應(yīng)分別－4.4、 －3.1和－3.6 d，加性效應(yīng)百分率分別為－3.8%、－3.1%和－3.7%。表現(xiàn)為增效作用，在3個環(huán)境中加性效應(yīng)分別1.4、2.5和1.6 d，加性效應(yīng)百分率分別為1.3%、2.5%和1.6%。表現(xiàn)為增效作用，在3個環(huán)境中加性效應(yīng)分別12.8、3.0和11.3 d，加性效應(yīng)百分率分別為11.9%、3.0%和11.5%。表現(xiàn)為減效作用，在3個環(huán)境中加性效應(yīng)分別－12.7、－8.4、－11.5 d，加性效應(yīng)百分率分別為－11.7%、－8.5%和－11.7%。

表1 抽穗期 QTL的定位

表2 不同環(huán)境中抽穗期QTL效應(yīng)分析

AEC, Additive effect contribution.

3 討論

水稻產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等重要農(nóng)藝性狀都是由數(shù)量性狀控制的，研究這些數(shù)量性狀的遺傳機(jī)制對于水稻遺傳育種具有非常重要的意義。用于數(shù)量性狀基因位點(diǎn)定位的群體包括傳統(tǒng)定位群體和次級群體。傳統(tǒng)定位群體主要包括F2、F3、BC1、DH、RILs等，是將2個遺傳差異很大的原始親本相互雜交而建立的分離群體，其特點(diǎn)是全基因組均發(fā)生分離，但QTL之間存在較復(fù)雜的互作和個體間遺傳背景的干擾。次級群體主要包括染色體片段代換系、近等基因系、導(dǎo)入系等，是在傳統(tǒng)群體的基礎(chǔ)上，通過回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建的群體，其特點(diǎn)是與其受體親本之間只存在導(dǎo)入片段的差異，從而可以消除群體內(nèi)遺傳背景的干擾，將復(fù)雜性狀分解為簡單性狀。Yano等[16]利用日本晴和Kasalath雜交后不同的后代群體控制水稻抽穗QTL進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)次級群體檢出的目標(biāo)抽穗期QTL數(shù)量多于傳統(tǒng)的定位群體，究其原因主要是由于遺傳背景的干擾，大效應(yīng)QTL對小效應(yīng)QTL的掩蓋作用，傳統(tǒng)的定位群體很難檢測到效應(yīng)小的QTL；另一個原因可能是因?yàn)镼TL上位性互作效應(yīng)的影響；次級群體在相似的遺傳背景下對數(shù)量性狀的QTL進(jìn)行分析，消除了大部分遺傳背景的干擾，提高了分析的靈敏度，檢出了較多的QTL。

在利用次級群體進(jìn)行抽穗期QTL精細(xì)定位和克隆研究方面，周勇等[17]利用染色體單片段代換系及其衍生群體將精細(xì)定位在第8染色體上的S8111和S849之間約59.9 kb的區(qū)間內(nèi)。Pei等[18]利用染色體單片段代換系構(gòu)建的F2及其衍生群體將定位在第8染色體上的RM22492 和 P23之間26 kb區(qū)間內(nèi)。Wang等[19]利用染色體單片段代換系及其衍生的分離群體將精細(xì)定位在第4染色體上的WB05和WB06之間約20.7 kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間內(nèi)共有3個候選基因。Yano等[20-21]利用日本晴為受體親本，Kasalath為供體的近等基因系構(gòu)建分離群體，精細(xì)定位并克隆了編碼產(chǎn)物包含395個氨基酸，含有鋅指結(jié)構(gòu)域，是擬南芥帶有鋅指結(jié)構(gòu)域的家族的一員。在以日本晴為受體親本，Kasalath為供體親本的高世代回交群體中精細(xì)定位并克隆了抽穗期QTL，編碼酪蛋白激酶CK2的α亞基，日本晴的等位基因可以看作是一個自然發(fā)生的座位上的CK2α無效突變。與水稻光周期敏感性有關(guān)，來自Kasalath的等位基因在長日照和自然生長條件下延遲水稻抽穗，而在短日照下則不能延遲水稻抽穗[22-23]。Hori等[24]分別利用日本晴、Koshihikari為受體，Koshihikari和日本晴為供體構(gòu)建了抽穗期QTL，編碼酪蛋白激酶CKI，長日條件下通過磷酸化，從而增強(qiáng)其功能來下調(diào)和其下游基因如和的轉(zhuǎn)錄水平，最終延遲開花。[25]利用以Kitaake為背景導(dǎo)入PA64S片段的38個近等基因系克隆到抽穗期QTL?？刂扑竟庵芷诿舾行院凸攘．a(chǎn)量的主效遺傳位點(diǎn)，編碼一個PRR(pseudo-response regulator)蛋白，其表達(dá)受到光周期調(diào)控。

染色體片段代換系大大提高了QTL定位的準(zhǔn)確性和精確性，但由于分子標(biāo)記數(shù)目的有限性和染色體雙交換的客觀存在，基于分子標(biāo)記檢測來確定代換系的遺傳背景和代換片段的信息總是有限的，有可能造成QTL定位的誤差。隨著新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，通過全基因組重測序，準(zhǔn)確鑒定染色體片段代換系的遺傳背景和代換片段的信息，繪制基于染色體片段的覆蓋基因組的Bin-map圖譜，實(shí)現(xiàn)QTL精確定位。

本實(shí)驗(yàn)室對秈稻品種9311為受體、粳稻品種日本晴為供體構(gòu)建的128個染色體片段代換系進(jìn)行高通量全基因組重測序，根據(jù)測序物理圖譜及代換片段的切割信息，繪制了包含401個Bin的代換片段Bin-map圖譜，利用該套重測序的染色體片段代換系群體準(zhǔn)確定位了8個粒形相關(guān)的QTL和14個劍葉形態(tài)相關(guān)的QTL[26-27]。本研究利用這個染色體片段代換系群體在揚(yáng)州和南京2個環(huán)境，不同年份對水稻抽穗期進(jìn)行鑒定，定位了6個在不同地區(qū)和年度間穩(wěn)定表達(dá)的抽穗期QTL，并將他們界定到具體的染色體區(qū)段上。根據(jù)整合分子標(biāo)記的物理圖譜，對本研究定位到的抽穗期QTL與前人研究結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與王軍等[7]定位的抽穗期QTL、Lee等[28]定位的抽穗期QTL在同一染色體區(qū)段上；與王軍等[7]定位的抽穗期QTL在相同的染色體區(qū)段上；與王軍等[28]定位的抽穗期QTL、何鳳華等[10]定位的抽穗期QTL、張永生等[29]定位的抽穗期QTL、Pei等[18]定位的抽穗期QTL在相同或位置相近的染色體區(qū)段上。與前人相比，利用重測序構(gòu)建的染色體片段代換系Bin-map圖譜可以將QTL定位在更小的區(qū)段內(nèi)，本研究中的6個抽穗期QTL被定位在45~760 kb的區(qū)段內(nèi)，其中被定位在第2染色體上約45 kb區(qū)間內(nèi)；被定位在第3染色體上約148 kb區(qū)間內(nèi)；被定位在第5染色體上約213 kb區(qū)間內(nèi)，這充分證明了重測序染色體片段代換系群體在QTL鑒定和定位方面的優(yōu)勢。利用帶有目標(biāo)QTL的染色體片段代換系與受體親本9311雜交，構(gòu)建F2及其衍生分離群體，有望快速實(shí)現(xiàn)這些QTL的精細(xì)定位和克隆，為進(jìn)一步探明抽穗期QTL的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Mapping of QTLs for Heading Date Using Whole-genome Re-sequenced Chromosome Segment Substitution Lines in Rice

WANG Jun1,2, ZHU Jinyan2, TAO Yajun1, ZHOU Yong1, FAN Fangjun2, LI Wenqi2, WANG Fangquan2, ZHONG Weigong2, YANG Jie2,*, LIANG Guohua1,*

(1Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Function Genomics, Ministry of Education Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: ricegb@yzu.edu.cn)

【Objective】Heading date is an important agronomic trait in rice, it is a typical quantitative trait controlled by multiple genes. As novel research material, chromosome segment substitution lines are useful in QTL fine mapping and cloning because of minimizing the interference of genetic background among plants. 【Method】In this study, 128 whole-genome re-sequenced chromosome segment substitution lines derived from Nipponbare as donor parent in the background of 9311, were used for mapping QTLs for heading date by combining the sequencing-based Bin-map with multiple linear regression analysis. 【Result】Six QTLs for heading date were identified in two environments and two years.was mapped in the region of 759848 bp on the chromosome 2;was mapped in the region of 45286 bp on the chromosome 2;was mapped in the region of 147931 bp on the chromosome 3;was mapped in the region of 213351 bp on the chromosome 5;was mapped in the region of 442305 bp on the chromosome 5;was mapped in the region of 538176 bp on the chromosome 8. 【Conclusion】The results are important for the QTLs cloning and providea foundation for understanding molecular regulation mechanism of heading date in rice.

rice; chromosome segment substitution lines; re-sequenced; heading date

10.16819/j.1001-7216.2017.7017

Q343.1+5; S511.01

A

1001-7216(2017)04-0364-07

2017-02-08；

國家973計劃資助項(xiàng)目(2013CBA01405)；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303102)；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(BE2015355，BE2015341); 揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)前瞻性研究資助項(xiàng)目(YZ2014165)。

修改稿收到日期：2017-03-08。