蒲小秋，白紅進(jìn)，馬倩倩，吳翠云,*

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團南疆特色果樹生產(chǎn)工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

HPLC-ELSD法同時測定鮮棗果實中不同種類可溶性糖含量

蒲小秋1，白紅進(jìn)2，馬倩倩2，吳翠云1,*

（1.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團南疆特色果樹生產(chǎn)工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器建立鮮棗果實中不同種類可溶性糖含量的測定方法。結(jié)果表明：適宜分離條件為Waters XBridgeTMAmide色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為0.2%三乙胺的超純水溶液，流動相B為0.2%三乙胺-乙腈溶液，兩相體積比為24∶76，柱溫30 ℃，霧化管溫度60 ℃，漂移管溫度60℃，氣流量1.6 L/min，增益值1.0。在該條件下鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖均能得到較好分離（分離度≥1.5），在0.099～1.040 ng/μL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，8 種糖的加標(biāo)回收率在93.1%～111.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%；檢出限（RSN=3）在0.008～0.03 ng/μL之間。該方法具有操作簡便、分離效果好、分離時間短等特點，可用于鮮棗果實中不同種類可溶性糖含量的測定，與傳統(tǒng)方法相比較更加靈敏準(zhǔn)確，有利于品質(zhì)鑒定。

鮮棗；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器；水溶性糖；單糖；低聚糖

棗（Ziziphus jujube Mill.）為鼠李科棗屬植物，在我國栽培面積僅次于蘋果和柑橘，產(chǎn)量（占世界99%）居干果中第1位[1]。新疆位于我國西北部，地域遼闊，土地資源豐富，屬溫帶大陸性氣候，日照時間長、晝夜溫差大，其優(yōu)越的地理環(huán)境促使新疆棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，截止到2012年9月，新疆全區(qū)紅棗面積已達(dá)675萬 畝[2]，研究認(rèn)為新疆產(chǎn)棗果的品質(zhì)優(yōu)于內(nèi)地，遠(yuǎn)超過其原產(chǎn)地[3-5]。棗果實主要營養(yǎng)成分有糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、無機元素、維生素及其他活性物質(zhì)，是深受人們喜愛的藥食兼用品種[6-8]，其中棗果實糖分的種類、含量及比率對果實風(fēng)味、色澤和其他營養(yǎng)成分有重要影響，是決定棗果實品質(zhì)和商品價值的主要因素[9]。

王永康[10]制定的優(yōu)異種質(zhì)資源判定標(biāo)準(zhǔn)指出，可溶性固形物含量、可溶性糖含量等指標(biāo)是棗果品質(zhì)評價的重要指標(biāo)。果實中可溶性糖分的測定方法有分光光度法、氣色相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[11]。HPLC法測定果實中可溶性糖含量時步驟相對簡單，對單糖和低聚糖的分析效果較好，被廣泛應(yīng)用于糖類的檢測[12-15]。目前利用HPLC法測定棗果實糖含量已有報道，孫濤等[12]利用HPLC和示差檢測器檢測山西交城縣的駿棗、河南新鄭的灰棗及南疆部分地區(qū)的駿棗糖組分，測得4 種糖組分分別為果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖；趙仁邦[16]利用利用HPLC和示差檢測器檢測出阜平大棗中存在鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖，多糖酸解液中檢測出鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組分；吉爽爽[17]利用HPLC和紫外檢測器測定了8 種棗品種多糖組成，結(jié)果表明8 個品種棗多糖中均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等單糖，但其單糖組成比例差異較大。不同測定方法的結(jié)果往往差異較大，同一種方法應(yīng)用于不同的植物多糖其差異也較大。利用HPLC和蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）同時測定不同鮮棗品種中鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量鮮有報道。

本研究旨在利用HPLC和ELSD聯(lián)用技術(shù)，建立同時測定鮮棗果實中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖含量的方法，并與分光光度法進(jìn)行比較，旨在找出快捷、準(zhǔn)確測定鮮棗果實中多種糖組分及準(zhǔn)確判斷棗品質(zhì)的方法，以期對果實品質(zhì)鑒定和資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2015年9月下旬到10月上旬采集于塔里木大學(xué)棗種質(zhì)資源圃的成熟棗果。品種分別為：京39、新鄭紅1號、金絲小棗、樂金3號、滕州躺棗、灰棗、駿棗、觀音棗、金絲蜜和冬棗。在品種資源圃中選擇樹體、樹齡（6～8 a生）基本一致的棗樹，根據(jù)棗成熟果實的取樣標(biāo)準(zhǔn)在每個品種樹冠外圍中上部相同方位分別隨機采摘20 個果實，液氮速凍后-80 ℃保存。為保證不同品種之間果實成熟度的一致性，成熟果實的取樣標(biāo)準(zhǔn)為果實充分著色后5 d進(jìn)行采樣。

可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品檢驗所；乙腈和三乙胺（triethylamine，TEA）均為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型HPLC儀（配有G1311C型四元泵、G1329B自動控溫自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4260B ELSD、OpenLAB CDS色譜工作站） 美國Agilent公司；FA1104N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；H2100R高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；RV-10控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters XBridgeTMAmide色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相A為含0.2% TEA的超純水溶液，流動相B為0.2% TEA-乙腈溶液，兩相體積比為24∶76；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

ELSD參數(shù)：霧化管溫度60 ℃；漂移管溫度60 ℃；增益值1.0；載氣為氮氣；流速1.6 L/min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、L-甘露糖、D-葡萄糖、D-蔗糖、D-麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g（精確至0.000 1 g），用超純水溶解并定容至2 mL，搖勻，此溶液質(zhì)量濃度均為5 ng/μL，過0.45 μm微孔濾膜，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時，將糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋配制成1、0.8、0.6、0.4、0.2、

0.1 ng/μL 6 個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3 供試樣品的制備

精密稱取1.000 g速凍果肉，低溫冷凍研磨儀研磨，加10 mL 80%乙醇溶液，80 ℃水浴30 min，4 000 r/min離心10 min取上清液，殘渣用80%乙醇溶液重復(fù)提取2 次，合并濾液，減壓蒸餾除去乙醇，用超純水定容至25 mL，過0.45 μm微孔濾膜，濾液用于測定棗果中的可溶性糖含量。

1.3.4 分光光度分析法

還原糖、蔗糖和總糖含量的測定參照張友杰[18]的方法，可溶性固形物的測定參照趙志華等[19]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相和色譜柱溫度的選擇

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和冬棗樣品（B）HPLC譜圖Fig. 1 Chromatograms of mixed sugar standards (A) and watersoluble sugars from Dongzao jujube (B) by HPLC analysis

本實驗選擇Waters XBridgeTMAmide（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，考察糖類化合物在該色譜柱上的分離情況。結(jié)果表明，在流動相中加入TEA時可以防止待測糖分同分異構(gòu)體的出現(xiàn)，使峰形尖銳，但信噪比增加，且TEA含量過高會造成色譜柱損傷；提高流動相中水的比例可縮短分離時間，但分離效果變差峰重疊，特別是麥芽糖和乳糖，降低流動相中水的比例可增加分離度，但分離時間延長、峰展寬嚴(yán)重；升高柱溫可使峰形變得尖銳，信噪比降低，但分離度下降。綜合考慮以上因素，以含0.2% TEA的超純水溶液作為A相，以0.2% TEA-乙腈溶液作為B相，兩相體積比為24∶76，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃時可以實現(xiàn)基線分離（分離度≥1.5），如圖1所示。

2.1.2 ELSD條件的選擇

漂移管溫度和載氣流速是ELSD的2 個重要參數(shù)，漂移管溫度影響檢測器的響應(yīng)，溫度升高，流動相蒸發(fā)趨于完全，信噪比上升，但溫度過高，可能導(dǎo)致分析物部分汽化，信號響應(yīng)值變小。霧化載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測器的響應(yīng)，信噪比隨載氣流速的增加而升高，但當(dāng)霧化氣流量過大時，氣溶膠液滴的變小會造成待測成分響應(yīng)信號較大程度的降低，增益值越高信號響應(yīng)值越大，但信噪比增加，一般選用1.0，增益值的高低取決于樣品含糖量。因此，綜合考慮本實驗選擇霧化器溫度60 ℃，漂移管溫度60 ℃，增益值1.0，氮氣為載氣，流速1.6 L/min，可達(dá)到最小的噪聲信號，色譜圖基線平穩(wěn)。

2.2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.099～1.040 ng/μL之間呈良好的線性關(guān)系；將最小質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，依次進(jìn)樣10 μL，以信噪比為3時的質(zhì)量濃度作為檢出限（detection of limit，LOD），LOD在0.008～0.03 ng/μL之間，表明該方法的靈敏性良好，如表1所示。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品可溶性糖含量線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、LODTable 1 Linear equation, correlation coefficient (r2) and limit of detection LOD of water-soluble sugars in mixed standard solution determined by HPLC-ELSD

2.3 精密度和重復(fù)性結(jié)果

取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，每次10 μL，記錄峰面積，得到8 種可溶性糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為鼠李糖0.73%、阿拉伯糖1.95%、果糖0.88%、甘露糖0.41%、葡萄糖0.30%、蔗糖0.81%、麥芽糖0.62%、乳糖0.58%，在0.30%～2.00%范圍內(nèi)，表明該方法的精密度良好。

取一批鮮棗果樣5 份，按照1.3.3節(jié)方法制備5 份供試品溶液，在選定色譜條件下各進(jìn)樣10 μL，以峰面積為指標(biāo)，其RSD分別為鼠李糖1.41%、果糖1.60%、葡萄糖0.95%、蔗糖1.80%、麥芽糖1.50%、乳糖1.80%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 回收率實驗結(jié)果

已知糖含量的棗果實樣品中分別取5 份，準(zhǔn)確加入1 ng/μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL后，按照1.3.3節(jié)制備供試品溶液，在相同色譜條件下進(jìn)行測定，計算其平均回收率，各可溶性糖平均回收率在93.1%～111.2%之間，表明該方法準(zhǔn)確率較高，如表2所示。

表2 8 種糖的回收率Table 2 Recoveries of eight sugars

2.5 10 個棗品種脆熟期果實糖組分含量的比較

表3 HPLC-ELSD法測定鮮棗果實中不同種類可溶性糖含量Table 3 Contents of water-soluble sugars in fresh jujube determined by HPLC-ELSD

從表3可以看出，不同棗品種脆熟期果實的可溶性糖種類和含量存在一定差異。在所有參試品種中都檢測到了果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，鼠李糖僅在金絲小棗和冬棗中被檢測到，阿拉伯糖僅在灰棗、駿棗和冬棗中檢測到，乳糖僅在京39、新鄭紅1號、金絲小棗、駿棗和冬棗中被檢測到，甘露糖在所有參試品種中都未檢測到，這與相關(guān)研究[20-22]結(jié)果一致，被檢測到的鼠李糖、阿拉伯糖、麥芽糖和乳糖含量都很低；游離的單糖和雙糖主要是果糖、葡萄糖和蔗糖，占總糖的98.9%～99.8%。在所有參試品種中果糖含量高于葡萄糖，其中，樂金3號果糖和葡萄糖含量均高于其他品種，分別為11.831%、10.871%；金絲蜜果糖和葡萄糖的含量均低于其他品種，分別為3.288%、2.669%；除灰棗和樂金3號外其他供試品種蔗糖＞果糖＞葡萄糖，金絲蜜蔗糖含量最高，樂京3號蔗糖含量最低，分別為27.808%、7.522%。

2.6 HPLC-ELSD法與分光光度法的比較

表4 分光光度法與HPLC-ELSD分別測定棗果實中還原糖、蔗糖和可溶性總糖含量Table 4 Contents of reducing sugar, sucrose and total soluble sugars in fresh jujube determined by spectrophotometry and HPLC-ELSD

由表4可以看出，分光光度法和HPLC-ELSD法測定還原糖、蔗糖和可溶性總糖基本一致，均為金絲蜜還原糖含量最低，京39可溶性總糖含量最低；樂京3號蔗糖含量最低，還原糖含量最高；金絲小棗可溶性總糖含量最高；但就RSD而言分光光度分析法明顯高于HPLC-ELSD法，因此判斷測定鮮棗果實還原糖、蔗糖和可溶性總糖HPLC-ELSD法優(yōu)于分光光度分析法。

利用SSPS對表4進(jìn)行相關(guān)性分析得到：分光光度分析法測得的還原糖、蔗糖和可溶性總糖與HPLC-ELSD測得結(jié)果呈極顯著正相關(guān)r2分別為0.985、0.907和0.961，說明本實驗的HPLC-ELSD測定結(jié)果與分光光度分析法測定的結(jié)果基本一致。可溶性固形物與HPLC-ELSD測得總糖和分光光度分析法測得的總糖呈極顯著關(guān)系，r2分別為1.00和0.908，說明本實驗建立的HPLC-ELSD法測定棗果實糖含量比分光光度分析法更接近真實值，判斷一個品種的總糖含量高低采用本實驗建立的HPLC-ELSD法更加科學(xué)可靠；甜度與HPLC-ELSD測得的總糖和可溶性固形物含量呈極顯著正相關(guān)，r2分別為0.804和0.802，而與分光光度分析法測得的總糖無顯著關(guān)系，表明利用HPLC-ELSD測定棗果實總糖含量或測定可溶性固形物可以直接判斷品種的甜度，有利于品質(zhì)鑒定。

3 討 論

本實驗使用的分光光度法測定還原糖、蔗糖和可溶性總糖不需要昂貴的儀器，簡便快捷，但該方法干擾因素較多，如顯色試劑用量、顯色反應(yīng)時間、冷卻時間及沸水浴時間都影響其顯色，操作條件控制不好易引起誤差，如王宏軍等[24]研究發(fā)現(xiàn)顯色試劑用量過多或過少都會使結(jié)果偏??；崔宏春[25]研究發(fā)現(xiàn)待測液冷卻時間不夠，測定時反應(yīng)還未終止，使測定結(jié)果不準(zhǔn)確，穩(wěn)定性也較差，冷卻時間過長，將使絡(luò)合反應(yīng)過度，生成的化合物會發(fā)生進(jìn)一步聚合，產(chǎn)生其他物質(zhì)，造成結(jié)果偏??；位杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)顯色時間與糖含量之間呈負(fù)相關(guān)，隨著顯色時間的延長，可溶性糖含量逐漸下降。

利用分光光度法只能測定還原糖總量，對還原糖的種類沒有選擇；測定出的蔗糖結(jié)果常比實際值偏高，實際是以蔗糖表示的一類糖的集合，這個集合體中很可能含有非蔗糖成分，使用分光光度法對蔗糖未知物的鑒定將顯示出盲目性。

利用HPLC-ELSD法測定鮮棗果實可溶性糖含量時步驟相對簡單，無需衍生化，可溶性糖的分析效果較好，ELSD是基于色譜柱流出物霧化后的不揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒的光散射電信號對樣品的定性定量測定分析，對物質(zhì)的響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性，靈敏度高、無溶劑峰干擾，有利于檢測較低含量的蔗糖，被廣泛應(yīng)用于糖類的檢[27-30]。

本實驗建立了鮮棗果實中鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖8 種單糖和雙糖的同時分離檢測的HPLC-ELSD方法。研究結(jié)果表明，該檢測方法樣品前處理簡便，檢測靈敏度較高，分析時間短，實際樣品檢測結(jié)果與分光光度法結(jié)果相比較表明，采用HPLC-ELSD法判斷棗品質(zhì)更加科學(xué)可靠。

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Simultaneous Determination of Water-Soluble Sugars in Fresh Jujube by High Performance Liquid Chromatography with Evaporative Light-Scattering Detector (HPLC-ELSD)

PU Xiaoqiu1, BAI Hongjin2, MA Qianqian2, WU Cuiyun1,*
(1. Engineering Laboratory of Characteristic Fruit Tree Production in Southern Xinjiang of Xinjiang Production and Construction Corps, College of Plant Science, Tarim University, Alar 843300, China; 2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alar 843300, China)

A method for the simultaneous determination of water-soluble sugars in fresh jujubes by high performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector (HPLC-ELSD) was established. The carbohydrates were separated on a chromatographic column of Waters XBridgeTMAmide (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of A (0.2% triethylamine aqueous solution) and B (0.2% triethylamine in acetonitrile) (A:B = 24:76, V/V). The column temperature was 30 ℃ and the atomization temperature was 60 ℃. The drift tube temperature of ELSD was 60 ℃. Nitrogen was used as the carried gas with a flow rate of 1.6 L/min and a gain value of 1.0. These experimental conditions allowed good separation of water-soluble sugars, such as rhamnose, arabinose, glucose, mannose, glucose, sucrose, maltose and lactose with a resolution of 1.5 or above. Good linearity was observed for the analytes in the concentration range of 0.099–1.040 ng/μL. The recoveries of spiked real samples ranged from 93.1% to 111.2%, with relative standard deviation (RSD) values below 5%. The limits of detection (RSN= 3) were in the range of 0.008–0.03 ng/μL. This method had a lot of advantages including simple operation, effective separation and time saving, and could be used to determine water-soluble sugars in fresh jujube. Compared with the traditional spectrophotometric method, HPLC-ELSD was more sensitive and accurate making it more suitable for quality identification of fresh jujube.

jujube fruit; high performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector (HPLC-ELSD); water-soluble sugar; monosaccharide; oligosaccharide

10.7506/spkx1002-6630-201714026

中圖分類號：S665.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-6630（2017）14-0170-05

蒲小秋, 白紅進(jìn), 馬倩倩, 等. HPLC-ELSD法同時測定鮮棗果實中不同種類可溶性糖含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 170-174.

10.7506/spkx1002-6630-201714026. http://www.spkx.net.cn

PU Xiaoqiu, BAI Hongjin, MA Qianqian, et al. Simultaneous determination of water-soluble sugars in fresh jujube by high performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector (HPLC-ELSD)[J]. Food Science, 2017, 38(14): 170-174. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714026. http://www.spkx.net.cn

2016-09-25

浙江大學(xué)馥莉食品研究院基金項目（KY201004）；兵團科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（2014CC006）；

新疆研究生科研創(chuàng)新項目（XJGRI2016128）

蒲小秋（1989—），女，碩士研究生，研究方向為果樹遺傳育種。E-mail：504797210@qq.com

*通信作者：吳翠云（1968—），女，教授，博士，研究方向為果樹種質(zhì)資源與品種選育。E-mail：wcyby@163.com