李 婷，潘 登，范奎奎，李海軍, 曹貴方, 杜晨光,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014109）

MC4R在小鼠下丘腦的定位及其基因在發(fā)情周期下丘腦、卵巢中的表達(dá)變化

李 婷1，潘 登1，范奎奎2，李海軍1, 曹貴方1, 杜晨光1,2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014109）

黑素皮質(zhì)素受體-4 (Melanocortin-4 Receptor，MC4R) 在參與調(diào)節(jié)攝食行為和機(jī)體能量平衡中發(fā)揮重要作用，但其在生殖活動(dòng)中的作用尚不明確。為此本實(shí)驗(yàn)以不同發(fā)情周期中的C57小鼠為對(duì)象，利用免疫熒光對(duì)MC4R神經(jīng)元在下丘腦的表達(dá)進(jìn)行定位。通過(guò)Western Blot確定MC4R在小鼠發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期的下丘腦和卵巢中蛋白表達(dá)變化。結(jié)果表明：MC4R神經(jīng)元廣泛分布于下丘腦第三腦室，發(fā)情期下丘腦中MC4R蛋白表達(dá)量顯著低于其他3個(gè)時(shí)期（P＜0.05）；同時(shí)期卵巢中MC4R蛋白表達(dá)量顯著低于發(fā)情前期和發(fā)情后期（P＜0.05），發(fā)情后期MC4R蛋白表達(dá)量極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期（P＜0.01）。這一結(jié)果闡明了小鼠在發(fā)情周期不同階段下丘腦和卵巢組織中MC4R的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究MC4R在小鼠生殖活動(dòng)中的作用提供理論基礎(chǔ)。

MC4R；發(fā)情周期；下丘腦；卵巢

Huszar等[1]首次利用基因敲除實(shí)驗(yàn)證明了MC4R基因缺失的小鼠表現(xiàn)食欲旺盛、肥胖等癥狀，提出了MC4R是參與調(diào)控能量平衡的關(guān)鍵信號(hào)物質(zhì)。Cui等[2]采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠確定MC4R神經(jīng)元主要分布在下丘腦外側(cè)區(qū)（Lateral Hypothalamic Area, LHA），其功能體現(xiàn)為發(fā)揮相應(yīng)采食及能量代謝平衡作用。有研究表明，MC4R亦參與動(dòng)物的生殖調(diào)控活動(dòng)。Sndrock等[3]證明MC4R基因敲除小鼠的卵巢黃體率顯著性低于野生型鼠，同時(shí)MC4R還參與了調(diào)控黃體周期性變化[4]。生殖活動(dòng)作為動(dòng)物機(jī)體代謝的特殊活動(dòng)形式，與能量代謝密不可分；MC4R的發(fā)現(xiàn)對(duì)理解能量平衡與生殖活動(dòng)之間的關(guān)系具有重要意義，有必要重新認(rèn)識(shí)MC4R在生殖活動(dòng)中的作用。

卵巢作為雌性動(dòng)物的性腺，主要受下丘腦和垂體調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮其正常的生殖功能，下丘腦含有的內(nèi)分泌腺的釋放因子可調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的分泌。而卵巢功能的反饋?zhàn)饔?，?duì)下丘腦也會(huì)產(chǎn)生積極影響。因此，本實(shí)驗(yàn)以MC4R在C57小鼠下丘腦及卵巢上的表達(dá)為切入點(diǎn)，利用陰道涂片的方法確定其發(fā)情周期，測(cè)定4個(gè)時(shí)期的下丘腦、卵巢2種不同組織中MC4R蛋白變化情況，分析MC4R神經(jīng)元在下丘腦的特異性分布情況，為了解MC4R在發(fā)情周期不同階段下丘腦及卵巢中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 C57小鼠下丘腦及卵巢組織的獲取與保存 采用陰道涂片法確定小鼠發(fā)情周期[5]。發(fā)情前期涂片觀察全部為有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；發(fā)情期全部是無(wú)核角化細(xì)胞或間有少量上皮細(xì)胞；發(fā)情后期均有白細(xì)胞、角化細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞；間情期有大量白細(xì)胞及少量上皮細(xì)胞和黏膜。分別選取不同發(fā)情階段的小鼠。脫臼處死后冰上分離小鼠的下丘腦和卵巢，直接凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Western Blot 將小鼠的下丘腦、卵巢組織液氮徹底研磨，在研碎的組織中加入200 μL PIPA裂解液（PIPA:PMSF=99:1），將其置于冰上用電動(dòng)馬達(dá)再次徹底研磨，進(jìn)行超聲破碎處理。12 000 r/min離心10 min，收集上清。將所得蛋白用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)蛋白樣濃度一致為2.3 μg/μL。用5%的濃縮膠、12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離所提蛋白。濕轉(zhuǎn)80 min后封閉1h。加入一抗MC4R抗體4℃過(guò)夜孵育，以GAPDH表達(dá)水平作為內(nèi)參照。洗膜后加入熒光二抗，室溫孵育1 h，于Odyessy掃描儀掃描結(jié)果。8 mL一抗稀釋液加入一、二抗比例信息見(jiàn)表1。二抗抗體來(lái)源于美國(guó)Abcam公司。

表1 抗體信息

1.3 免疫熒光 用新鮮配制的4%多聚甲醛（pH 7.4）對(duì)小鼠進(jìn)行灌注。取其下丘腦放于4%多聚甲醛內(nèi)4℃固定6～8 h，并將固定好的組織放于30%蔗糖溶液內(nèi)4℃脫水。OCT對(duì)組織進(jìn)行包埋，置于冰凍切片機(jī)上切片，切片厚度為30 μm。0.02 mol/L PBS 4℃過(guò)夜貯存。用0.4%TritonX-100進(jìn)行組織通透，封閉1 h。在一抗稀釋液中加入一抗：Rabbit anti-MC4R, ab24233, 1:500，美國(guó)Abcam公司，4℃過(guò)夜孵育一抗。在二抗稀釋液中加入二抗：Donkey Anti-Rabbit Alexa 647，1:800，美國(guó)Abcam公司，孵育1 h。將組織切片置于載玻片上貼片，過(guò)夜干燥，激光共聚焦顯微鏡（Nikon C2）下掃描組片。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差（One-Way ANOVA）分析統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，顯著性情況在圖中相應(yīng)位置標(biāo)注。

2 結(jié) 果

2.1 MC4R神經(jīng)元在下丘腦分布 由圖1可知，MC4R廣泛表達(dá)于C57小鼠第三腦室（3V）附近，且集中分布于下丘腦弓狀核（Arcuate Nucleus，ARC）、腹內(nèi)側(cè)核（ Ventromedial Hypothalamic Nucleus，VMH）、室旁核（Paraventricular Nucleus，PVN）等區(qū)域。

2.2 MC4R蛋白在小鼠發(fā)情周期下丘腦的變化Western blot結(jié)果表明，MC4R蛋白在小鼠下丘腦和卵巢均有表達(dá)，處于發(fā)情期時(shí)下丘腦組織中MC4R表達(dá)量顯著低于其他3個(gè)發(fā)情時(shí)期（P＜0.05）。發(fā)情前期、發(fā)情后期和間情期MC4R的表達(dá)無(wú)顯著性變化（P＞0.05）（圖2）。

圖1 MC4R在小鼠下丘腦的表達(dá)分布結(jié)果

圖2 發(fā)情周期MC4R蛋白在下丘腦中的蛋白表達(dá)變化

2.3 MC4R蛋白在小鼠發(fā)情周期卵巢的變化 小鼠處于發(fā)情期時(shí)，卵巢組織中的MC4R表達(dá)量顯著低于發(fā)情前期和發(fā)情后期（P＜0.05），與間情期相比無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。發(fā)情前期與間情期MC4R無(wú)顯著性變化。發(fā)情后期MC4R的表達(dá)量極顯著高于其他3個(gè)發(fā)情時(shí)期（P＜0.01）（圖3）。

圖2 發(fā)情周期MC4R蛋白在下丘腦中的蛋白表達(dá)變化

3 討 論

MC4R是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)調(diào)節(jié)能量代謝發(fā)揮重要作用的黑素皮質(zhì)素受體之一[6]。下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵樞紐，在調(diào)控采食及能量代謝平衡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，已有對(duì)哺乳動(dòng)物腦內(nèi)MC4R分布的研究報(bào)道證實(shí)MC4R在下丘腦中表達(dá)，Cui等[2]采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠確定MC4R神經(jīng)元主要分布于LHA。Liu等[7]利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠檢測(cè)到MC4R神經(jīng)元在PVH內(nèi)分布密度最高。本文通過(guò)免疫熒光技術(shù)直接檢測(cè)到MC4R神經(jīng)元在下丘腦第三腦室周圍廣泛表達(dá)，且主要分布于ARC、VMH、PVN區(qū)域。本研究與前人的研究顯示，小鼠下丘腦MC4R分布的神經(jīng)核團(tuán)不僅調(diào)節(jié)動(dòng)物的采食，而且是含有促黃體激素釋放激素（LHRH）、促性腺激素釋放激素（GnRH）等多種與生殖有關(guān)激素的主要核團(tuán)，它們參與動(dòng)物生殖活動(dòng)的調(diào)控[8]。另外，MC4R可以增加GnRH神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位[9]，而GnRH可刺激垂體促性腺激素的分泌，進(jìn)而影響動(dòng)物的生殖活動(dòng)；過(guò)表達(dá)MC4R的拮抗劑AgRP在導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體肥胖的同時(shí)還會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生不孕癥狀[10]。研究顯示，MC4R與生殖活動(dòng)之間存在必不可少的聯(lián)系。

本研究結(jié)果表明，MC4R在小鼠下丘腦和卵巢組織中的蛋白表達(dá)分布與發(fā)情周期的變化有著密切的關(guān)系，發(fā)情后期卵巢對(duì)下丘腦可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，其他3個(gè)時(shí)期下丘腦對(duì)卵巢存在正向調(diào)控。發(fā)情周期作為雌性動(dòng)物生殖發(fā)育中的一個(gè)重要過(guò)程，從神經(jīng)內(nèi)分泌角度講，受3個(gè)基本部位分泌作用的調(diào)控：下丘腦的肽能神經(jīng)元、垂體前葉的促性腺物質(zhì)和位于卵巢的類固醇分泌細(xì)胞。其中，起主要作用的是下丘腦周期性釋放GnRH，表現(xiàn)為循環(huán)中FSH、LH、雌激素的變化[11]。有報(bào)道指出，血清高濃度的雌激素水平出現(xiàn)在發(fā)情期。本研究結(jié)果顯示，處于發(fā)情期的MC4R在小鼠下丘腦和卵巢表達(dá)量均最低，此現(xiàn)象與血清中雌激素含量呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)MC4R對(duì)血清中雌激素含量有下調(diào)作用。

下丘腦是哺乳動(dòng)物內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的皮下調(diào)控中樞，與垂體、卵巢組成下丘腦-垂體-卵巢（Hypothalamus-pituitary-ovary，HPO）軸，調(diào)節(jié)及維持雌性動(dòng)物的正常生殖功能。Smith等[12]研究表明，下丘腦-垂體-性腺（Hypothalamicpituitary- gonad，HPG）軸對(duì)能量代謝很敏感，能量的變化會(huì)引起其功能的調(diào)整，從而導(dǎo)致激素分泌的變化。而雌激素的分泌主要受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)。因此，作為能量代謝的關(guān)鍵信號(hào)，MC4R可能通過(guò)HPO軸調(diào)節(jié)雌激素的分泌，從而完成對(duì)整個(gè)發(fā)情周期的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)得出MC4R基因在小鼠發(fā)情周期不同階段的下丘腦和卵巢中呈規(guī)律性變化，發(fā)情期下丘腦、卵巢中MC4R蛋白表達(dá)量均最低。MC4R神經(jīng)元在下丘腦三腦室附近的廣泛分布及其基因與小鼠發(fā)情周期的相關(guān)性，揭示了能量代謝與生殖之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步研究MC4R在卵巢中的作用提供依據(jù)。

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Localization and Expression of MC4R in Mouse Hypothalamus and Ovary during Estrous Cycle

LI Ting1, PAN Deng1, FAN Kui-kui2, LI Hai-jun1, CAO Gui-fang1, DU Chen-guang1,2*
(1. College oVeterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Hohhot 010018, China; 2. Vocational and Technical College, Inner Mongolia Agricultural University, Inner Mongolia Baotou 014109, China)

Melanocortin-4 receptor (MC4R) plays an important role ineeding behavior and body weight regulation, While itsunction in reproductive activities is not clear. So, we used C57 mice in dierent estrus cycles to locate MC4R by immunouorescence technique. Western blot was used to determine the expression omelanocortin-4 receptor protein in the proestrus, estrus, metestrus and diestrus omouse hypothalamus and ovary. The results showed, MC4R were widely distributed in the third ventricle othe hypothalamus. The expression oMC4R in the estrus ohypothalamus was signicantly lower than that in the other three periods (P ＜0.05). Meanwhile, the expression oMC4R in the ovaries was signicantly lower than that in the proestrus and diestrus (P ＜0.01), and the MC4R was signicantly higher in the diestrus (P ＜0.01) than in the other three periods. The results showed that the changes oMC4R expression in hypothalamus and ovary tissue in dierent stages oestrus cycle, which would provide a theoretical basisorurther study oMC4R in mouse reproductive activity.

MC4R; Estrous Cycle; Hypothalamus; Ovary

S865.1+30.3

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-025

2016-10-31；

2016-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（31160455）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2014MS0323）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2013M541212）作者簡(jiǎn)介：李婷（1990-），女，碩士，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物組織與胚胎發(fā)育生物學(xué)，E-mail：lt_5029@sina.com

* 通訊作者：杜晨光（1976-），男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物組織與胚胎發(fā)育生物學(xué)，E-mail： dcglxj@163.com