田占偉++趙宗勝++林杉++翟曼君++于要升++雷小萍

摘要：旨在通過檢測乏情期和發(fā)情期的發(fā)情綿羊外周血液中4種重要生殖激素孕酮（P4）、雌激素（E2）、促卵泡素（LH）和促黃體素（FSH）濃度，解析綿羊乏情期和發(fā)情期哈薩克綿羊發(fā)情時生殖激素的變化規(guī)律，以期闡明哈薩克綿羊發(fā)情時生殖激素變化規(guī)律，為調(diào)控綿羊的季節(jié)性發(fā)情提高激素方面的理論。采用ELISA方法測定4種生殖激素濃度，結(jié)果表明：哈薩克綿羊P4和E2在發(fā)情周期內(nèi)呈現(xiàn)波動式變化，LH和FSH在發(fā)情周期內(nèi)呈現(xiàn)脈沖式變化，且乏情期和發(fā)情期4種激素濃度變化顯著（P<0.05）。

關鍵詞：哈薩克綿羊；乏情期；發(fā)情期；生殖激素

中圖分類號： S826.8+43文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0256-04

收稿日期：2015-03-18

基金項目：新疆生產(chǎn)建設兵團博士資金專項（編號：2013BB019）；國家自然科學基金（編號：31260537）。

作者簡介：田占偉（1988—），男，山西大同人，碩士研究生，主要從事動物分子遺傳研究。E-mail：997741489@qq.com。

通信作者：趙宗勝（1969—），男，新疆石河子人，博士，教授，主要從事動物分子遺傳研究。E-mail：zhaozongsh@shzu.edu.cn。動物的季節(jié)性發(fā)情是其通過長期的自然選擇逐漸演化而形成的。有研究表明，綿羊一般屬于季節(jié)性發(fā)情的動物，在短日照的秋季開始發(fā)情[1]。其季節(jié)性發(fā)情受到下丘腦——垂體——卵巢（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG）系統(tǒng)的調(diào)控[2]，與綿羊的生殖激素有著密切的聯(lián)系。

目前國內(nèi)外專家學者對綿山羊生殖激素季節(jié)性變化進行了相關的報道。Suttie等對綿羊的P4分泌規(guī)律進行相關的研究發(fā)現(xiàn)，短日照可以促進P4分泌，而長日照則對P4的分泌具有明顯的抑制作用[3]；Smith等報道，哺乳動物一般在發(fā)情前會出現(xiàn)一次E2峰[4]；Chemineau等研究發(fā)現(xiàn)綿山羊繁殖季節(jié)血液中LH和FSH濃度均存在著季節(jié)性變化，而且繁殖季節(jié)高于非繁殖季節(jié)[5]；賀建寧等研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性發(fā)情的灘羊在春、夏、秋、冬4個季節(jié)生殖激素變化顯著，而常年發(fā)情的小尾寒羊生殖激素在四季變化基本穩(wěn)定[6]。

哈薩克綿羊為典型的季節(jié)性發(fā)情綿羊品種，是我國三大綿羊品種之一，產(chǎn)肉性能較高，尤其羔羊生長發(fā)育快，4～4.5月齡（斷奶期間）就可出欄，是生產(chǎn)羔羊肉的理想品種[7]，具有重要的經(jīng)濟價值，哈薩克羊?qū)Ρ苯貐^(qū)的生態(tài)環(huán)境和飼草料條件具有很強的適應性，是新疆寶貴的遺傳資源，但綿羊的季節(jié)性發(fā)情嚴重制約著哈薩克羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究以哈薩克綿羊為研究對象，分別檢測哈薩克綿羊乏情期和發(fā)情期的發(fā)情綿羊生殖激素的含量，以期闡明哈薩克綿羊發(fā)情的生殖激素變化規(guī)律，為調(diào)控綿羊的季節(jié)性發(fā)情提高激素方面的理論。

1材料與方法

1.1試驗動物

選擇年齡相近、體質(zhì)量接近、健康的哈薩克成年母羊36只，飼養(yǎng)與免疫措施一致，飼養(yǎng)于石河子大學實驗站。每天讓羊自主采食苜蓿，自由飲水，管理和環(huán)境條件一致，欄內(nèi)散放。

1.2哈薩克綿羊發(fā)情特征鑒定

乏情期為3—5月份，發(fā)情期為8—10月份。

綿羊的發(fā)情鑒定：采用公羊試情和外陰觀察相結(jié)合的方法。選擇成年種公羊，捆綁試情布，早晚各試情1次，并觀察綿羊外陰部的變化。試情公羊接近母羊，母羊主動靠近接受公羊爬跨，而且外陰部紅潤腫脹，并伴隨有黏液流出，鑒定為發(fā)情母羊。不發(fā)情綿羊則表現(xiàn)為遠離試情公羊，當強制牽引接近時，往往會出現(xiàn)躲避行為甚至踢、咬等抗拒行為。

1.3血液樣品采集及激素測定

選擇乏情期及發(fā)情期的發(fā)情綿羊，每天早晨8：00—9：00采集不抗凝血1次，每次3 mL，共40 d。37 ℃靜置2 h后，3 000 r/min 離心15 min，取上清液于干凈的1.5 mL離心管中，放入-20 ℃冰箱待測。用酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）試劑盒檢測血清中的P4、E2、LH和FSH的濃度。數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0 和Excel等統(tǒng)計軟件處理，計算以上4種激素在血清中的平均水平和標準差，并做相應的方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1哈薩克綿羊的發(fā)情特點

經(jīng)過在乏情期和發(fā)情期對試驗綿羊發(fā)情情況的觀察記錄，發(fā)現(xiàn)哈薩克綿羊發(fā)情表現(xiàn)明顯，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律：哈薩克羊乏情期成年母羊的發(fā)情周期為18～20 d，發(fā)情持續(xù)時間為24～48 h。

2.2哈薩克發(fā)情綿羊血液中P4、E2、LH和FSH在乏情期的變化規(guī)律

由表1可知，乏情期內(nèi)，哈薩克發(fā)情母羊P4的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)存在顯著的變化（P<0.05），呈現(xiàn)波動式變化，在發(fā)情周期的第13天達到最高值18.77 ng/mL；哈薩克發(fā)情母羊E2的分泌量在發(fā)情期內(nèi)變化顯著（P<0.05），呈現(xiàn)波動式變化，發(fā)情周期的第5、10、17天均出現(xiàn)局部峰值，與謝炳坤等發(fā)現(xiàn)哺乳動物通常在發(fā)情前后會有一個較低的P4水平，其變化有利于母畜進入下一個發(fā)情周期的研究[8]結(jié)果相同；哈薩克發(fā)情母羊LH的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)存在顯著變化（P<0.05），呈現(xiàn)脈沖式變化，發(fā)情周期的第4、17天，達到發(fā)情周期的最高值，顯著高于其他天數(shù)（P<0.05）；哈薩克發(fā)情母羊FSH的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)變化顯著（P<0.05），呈現(xiàn)脈沖式變化，在發(fā)情周期的前幾天出現(xiàn)脈沖波，在第5天達到峰值，此后回落。LH和FSH的變化與祁云霞等報道巴美肉羊的LH和FSH在發(fā)情期均呈脈沖式分泌的研究[9]結(jié)果一致，在發(fā)情期都有1個峰值。

2.3哈薩克發(fā)情綿羊血液中P4、E2、LH和FSH在發(fā)情期的變化規(guī)律

由表2可知，發(fā)情期內(nèi)，哈薩克發(fā)情母羊P4的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)存在顯著的變化，呈波動式變化，第13天前后的分泌量顯著高于其余幾天（P<0.05），發(fā)情周期的前4 d和后4 d P4的分泌量較低；E2的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)也存在顯著變化，呈波動式變化，第16、17、18天的分泌量顯著高于其他天數(shù)（P<0.05），與Smith等報道的哺乳動物一般在發(fā)情前會出現(xiàn)1次E2峰的結(jié)果[4]相一致；LH的分泌量在發(fā)情周期內(nèi)存在顯著變化，呈脈沖式變化，第4、17天的分泌量顯著高于其他天數(shù)（P<0.05），在第4天達到最高值；FSH的分泌規(guī)律與LH相似，呈脈沖式變化，在第5天的分泌量與發(fā)情周期內(nèi)的其他天數(shù)相比，結(jié)果差異顯著（P<0.05），且第5天的含量達到最大。發(fā)情期LH和FSH的變化趨勢與乏情期相似。本研究測定LH和FSH的分泌模式與侯衍猛推論的萊蕪黑山羊發(fā)情周期中促黃體素、卵泡刺激素分泌峰出現(xiàn)的時間可能與卵泡波出現(xiàn)的時間相吻合的研究結(jié)果[10]相似。

2.4哈薩克綿羊血液在乏情期和發(fā)情期血液中P4、E2、LH和FSH的變化比較

由圖1可知，哈薩克綿羊乏情期和發(fā)情期發(fā)情母羊同一個發(fā)情周期內(nèi)P4變化趨勢相同，在發(fā)情周期的第12、13、14、15、16天P4的發(fā)情期的發(fā)情母羊的P4分泌量顯著大于乏情期（P<0.05），其在發(fā)情周期的其他天數(shù)，發(fā)情期發(fā)情綿羊體內(nèi)P4的含量基本高于乏情期。研究結(jié)果與趙曉娥等研究P4主要由黃體分泌、呈波動式分泌[11]的結(jié)果一致。

由圖2可知，哈薩克綿羊乏情期和發(fā)情期發(fā)情母羊同一個發(fā)情周期內(nèi)E2變化趨勢相同，但在發(fā)情周期的第16、17、18天，乏情期和發(fā)情期發(fā)情綿羊的E2含量均達到發(fā)情周期的最高水平，且發(fā)情期發(fā)情綿羊E2的分泌量顯著高于乏情期（P<0.05），在發(fā)情周期的其他天數(shù)里，乏情期和發(fā)情期發(fā)情母羊E2的含量分泌穩(wěn)定。本研究結(jié)果與Smith等報道的哺乳動物一般在發(fā)情前會出現(xiàn)1次E2峰的結(jié)果[4]相一致，提示E2的大量分泌是綿羊發(fā)情的必要前提。

由圖3可知，哈薩克綿羊乏情期和發(fā)情期發(fā)情母羊同一個發(fā)情周期內(nèi)LH變化趨勢相同，發(fā)情期發(fā)情綿羊LH的分泌量在發(fā)情周期的第4、9、17、19天顯著大于乏情期（P<0.05），但在第15天，發(fā)情期發(fā)情綿羊LH的分泌量卻顯著低于乏情期（P<0.05），這可能與綿羊的個體差異性相關；在發(fā)情周期的其他天數(shù)乏情期和發(fā)情期LH的分泌量差異不顯著（P>0.05）。

由圖4可知，哈薩克綿羊乏情期和發(fā)情期的發(fā)情母羊同一個發(fā)情周期內(nèi)FSH變化趨勢相同，在發(fā)情周期的第1、4、5天，發(fā)情期發(fā)情綿羊FSH的分泌量極顯著高于乏情期的發(fā)情綿羊（P<0.01）；在發(fā)情周期的第6、8、11、13、16天，發(fā)情期發(fā)情綿羊FSH的分泌量顯著高于乏情期的發(fā)情綿羊（P<0.05）；研究結(jié)果與祁云霞等報道巴美肉羊的LH和FSH在發(fā)情期均呈脈沖式分泌[9]的研究結(jié)果一致，在發(fā)情期都有1個峰值。

3討論

3.1孕酮主要由卵巢上的黃體分泌

自然情況下，P4和E2通過協(xié)同和拮抗作用進行復雜的調(diào)節(jié)，共同作用于母畜的生殖活動。Suttie等對綿羊的P4分泌規(guī)律進行了相關研究發(fā)現(xiàn)，短日照可以促進P4分泌，而長日照則對P4的分泌具有明顯的抑制作用[3]，本試驗的哈薩克綿羊P4在乏情期和發(fā)情期的變化結(jié)果與之相一致。依據(jù)Sogorescu 等研究發(fā)現(xiàn)，喀而巴仟山羊進入繁殖季節(jié)后，P4的濃度開始升高，并在繁殖的旺盛期達到最大值[12]，本研究結(jié)果與之相一致，試驗中處于發(fā)情期的哈薩克綿羊P4的濃度普遍大于乏情期時P4的濃度，這可能與綿羊在發(fā)情期達到哈薩克綿羊發(fā)情的高峰期和綿羊個體之間的互相影響有關。

3.2雌激素由卵泡內(nèi)膜和顆粒細胞分泌

雌激素具有促進尚未成熟母畜生殖器官的生長發(fā)育，促使成年母畜發(fā)情等一系列與生殖生理有關的功能。Smith等報道哺乳動物一般在發(fā)情前會出現(xiàn)1次E2峰[4]，本研究結(jié)果與之一致，無論是在乏情期還是發(fā)情期，綿羊發(fā)情必然伴隨E2的大量分泌；高云芳等測定不同季節(jié)雌性川金絲猴尿液中的雌二醇濃度，結(jié)果顯示繁殖季節(jié)E2濾泡期和黃體期的分泌水平分別是非繁殖季節(jié)的72.13倍和89.91倍，表明E2的分泌具有顯著的季節(jié)性差異[13]；本研究結(jié)果與之相一致，試驗中發(fā)情期的哈薩克綿羊E2的含量高于乏情期，在發(fā)情周期的第17天左右遠遠高于乏情期E2的分泌量。但也有研究報道，E2的分泌量在薩福克綿羊的體內(nèi)四季保持相對穩(wěn)定的變化[14]，本研究結(jié)果與之不一致，這可能與綿羊的品種、所處地域及樣品的采集時間等不同有關。

3.3促黃體素是由垂體嗜堿性細胞分泌

促黃體素的作用是協(xié)同促卵泡素促使卵泡發(fā)育成熟，并分泌雌激素。據(jù)Chemineau等研究報道，山羊血液中LH的濃度存在明顯的季節(jié)性變化，乏情期濃度較低，進入發(fā)情期時顯著上升[5]；Billings等研究表明，薩?？司d羊在乏情季節(jié)母羊的LH濃度低，在發(fā)情季節(jié)LH的濃度較乏情季節(jié)高[15]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊、灘羊、同羊血液中的LH濃度及LH脈沖頻率有著明顯季節(jié)性變化，春分之時LH濃度低，而在夏至和秋分之時顯著升高[16]；本試驗結(jié)果與之相一致，哈薩克綿羊在發(fā)情期LH的分泌量高于乏情期綿羊的分泌量，并有顯著差異。

3.4促卵泡素是腺垂體嗜堿性細胞分泌的糖蛋白質(zhì)激素之一

促卵泡素可以促進綿羊子宮內(nèi)膜生產(chǎn)、排卵、刺激多卵泡發(fā)育等功能，同時也可刺激卵泡生長至成熟。祁云霞等報道巴美肉羊的LH和FSH在發(fā)情期均呈脈沖式分泌，在發(fā)情期都有1個峰值[9]；本試驗中測得無論乏情期還是發(fā)情期，發(fā)情母羊FSH在發(fā)情期內(nèi)均是呈現(xiàn)脈沖式變化，與其結(jié)果一致。Chemineau等研究發(fā)現(xiàn)綿山羊繁殖季節(jié)血液中LH和FSH濃度均存在著季節(jié)性變化，而且繁殖季節(jié)高于非繁殖季節(jié)[5]；本研究結(jié)果與之相一致，發(fā)情期哈薩克綿羊FSH的分泌量高于乏情期的分泌量。

4結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克綿羊在乏情期和發(fā)情期均可發(fā)情，而且發(fā)情表現(xiàn)明顯，并呈現(xiàn)一定的規(guī)律：哈薩克羊乏情期成年母羊的發(fā)情周期為18～20 d，發(fā)情持續(xù)時間為24～48 h。哈薩克綿羊P4和E2在發(fā)情周期內(nèi)呈現(xiàn)波動式，LH和FSH在發(fā)情周期內(nèi)呈現(xiàn)脈沖式變化，乏情期和發(fā)情期4種激素濃度變化顯著（P<0.05），發(fā)情期內(nèi)激素的濃度普遍高于乏情期內(nèi)激素的含量。

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