曲苗， 閆向民， 孫亞偉， 李娜， 王傳軍， 王成成， 李紅波， 張楊*， 姚剛

(1.新疆畜牧科學院 畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830000； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊市 830000；3.伊犁創(chuàng)景犇牛牧業(yè)有限公司，新疆 伊寧 835000)

隨著生活水平和質(zhì)量的提高，人們對肉的需求增大，肉牛的養(yǎng)殖規(guī)模隨之變大，肉牛的規(guī)?；B(yǎng)殖也逐漸增多。肉牛的品種有很多，世界上大約有250多種肉牛，美國大約有60種，加拿大約有34種[1]，中國現(xiàn)在的品種主要是西門塔爾牛、安格斯牛、夏洛萊牛等[2]。我國的西門塔爾牛是20世紀50年代從國外引進并與我國黃牛雜交后得到的穩(wěn)定品種[3]，在2014年我國雜交牛數(shù)量達1 200萬頭，其中西門塔爾肉牛所占的比例達到90%以上，成為我國主要的肉牛品種。

國外科研人員在20世紀中期就開始研究牛的生殖激素變化，有了較為詳盡的數(shù)據(jù)，牛的FSH與發(fā)情周期的變化規(guī)律就是由Akbar等[4]在1974年從牛的血漿中測定的。1969年Niswender等[5]對LH的水平進行了測定。在雌激素和孕激素的研究上，Smith[6]在1975年對牛的孕酮進行了研究。國內(nèi)的研究相對較晚，徐直等[7]在1996年研究了黑白花奶牛生殖激素含量的變化。

目前，有關(guān)西門塔爾肉牛不同時期生殖激素變化規(guī)律的報道相對較少，為了研究西門塔爾肉牛不同時期的生殖激素變化規(guī)律，本文通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測西門塔爾肉牛4個時期的E2、PROG、FSH、LH、PGE2、GnRH激素的濃度，分析西門塔爾肉牛不同時期各生殖激素的變化規(guī)律，為之后西門塔爾肉牛的繁育和生產(chǎn)性能的提高提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試肉牛是伊寧市某牛場隨機選取的產(chǎn)后13 d、生長環(huán)境和飼養(yǎng)管理一致的西門塔爾肉牛，共計16頭，在產(chǎn)后14、28、42 d使用氯前列醇鈉注射液(PG)對其進行同期發(fā)情處理，每頭牛每次注射PG 3 mL(0.1 mg·mL-1)。每隔1周在10:00 am采血樣5 mL，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清，液氮保存。

儀器。立式壓力蒸汽滅菌器(LDZF-30KB上海申安醫(yī)療器械廠)，電熱恒溫鼓風干燥箱(GZX-9070MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，酶標儀(ST-360：KHB公司)。

試劑。PGE2試劑盒，GnRH試劑盒，LH試劑盒，F(xiàn)SH試劑盒，PROG試劑盒，E2試劑盒均由武漢基因美公司所提供(批號：2020.04)，氯前列醇鈉注射液(PG寧波第二激素廠，0.2 mg×10支)，蒸餾水。

1.2 方法

使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[8]對產(chǎn)后恢復期(產(chǎn)后0～40 d)和3個發(fā)情期(第1發(fā)情期：產(chǎn)后41～62 d；第2發(fā)情期：產(chǎn)后63～84 d；第3發(fā)情期：產(chǎn)后85～106 d)共4個時期的E2、PROG、FSH、LH、PGE2和GnRH濃度進行測定[9-10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行計算，結(jié)果用平均值±標準誤進行表示，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，兩兩比較，并進行相關(guān)性分析，P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著，使用Excel對數(shù)據(jù)進行分析并作圖，觀察其變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期的生殖激素濃度比較

在4個時期中，E2濃度隨時間推移逐漸減小，產(chǎn)后恢復期E2濃度最高(圖1)。產(chǎn)后恢復期的PROG濃度最高，第2發(fā)情期的PROG濃度低于妊娠前期(圖2)。FSH濃度在第2發(fā)情期最高，在產(chǎn)后恢復期最低(圖3)。產(chǎn)后恢復期的LH濃度最高，LH濃度隨時間變化而降低(圖4)。第1發(fā)情期的PGE2濃度最大，之后2個時期的濃度逐漸降低(圖5)。產(chǎn)后恢復期的GnRH濃度最高，在第3發(fā)情期降低(圖6)。西門塔爾肉牛在產(chǎn)后恢復期與第3發(fā)情期的LH濃度差異性顯著，其他激素各時期差異性均不顯著(圖4)。

2.2 不同生殖激素濃度的變化規(guī)律

產(chǎn)后恢復期E2出現(xiàn)3個峰值，分別在產(chǎn)后16、27和34 d，產(chǎn)后16 d的E2濃度最高，為354.69 pg·mL-1，產(chǎn)后27 d的濃度為170.44 pg·mL-1，產(chǎn)后34 d的為164.74 pg·mL-1，在產(chǎn)后恢復期的濃度呈現(xiàn)穩(wěn)定的變化規(guī)律。之后3個發(fā)情期E2的濃度處于穩(wěn)定的變化范圍，在產(chǎn)后68 d時E2濃度最高，為121.97 pg·mL-1，產(chǎn)后72 d最低，為86.75 pg·mL-1(圖7)。

0—產(chǎn)后恢復期；1—第1發(fā)情期；2—第2發(fā)情期；3—第3發(fā)情期。圖2～6同。圖1 E2濃度差異性比較

圖2 PROG濃度差異性比較

圖3 FSH濃度差異性比較

*—差異顯著(P<0.05)。圖4 LH濃度差異性比較

圖5 PGE2濃度差異性比較

圖6 GnRH濃度差異性比較

圖7 不同時期E2濃度變化

產(chǎn)后恢復期的PROG濃度高于3個發(fā)情期，產(chǎn)后恢復期PROG濃度出現(xiàn)3個峰值，其中產(chǎn)后16 d時濃度最高，為19.48 ng·mL-1，產(chǎn)后27 d為13.35 ng·mL-1，產(chǎn)后34 d為13.94 ng·mL-1。發(fā)情期的PROG濃度相對穩(wěn)定，3個發(fā)情期均為前期的濃度較高，第1個發(fā)情期產(chǎn)后41 d的PROC濃度為9.08 ng·mL-1，第2個發(fā)情期產(chǎn)后68 d的為9.25 ng·mL-1，第3個發(fā)情期產(chǎn)后85 d的為8.98 ng·mL-1(圖8)。

圖8 不同時期的PROG濃度變化

產(chǎn)后恢復期前期FSH濃度呈上升趨勢，產(chǎn)后20 d后FSH濃度處于平穩(wěn)狀態(tài)。在產(chǎn)后13 d FSH濃度最低，為18.97 ng·mL-1，產(chǎn)后27 d FSH濃度最高，為66.28 ng·mL-1。第1發(fā)情期FSH濃度逐漸上升，產(chǎn)后58 d濃度最高，為70.42 ng·mL-1。第2發(fā)情期FSH濃度由產(chǎn)后68 d的98.60 ng·mL-1上升到產(chǎn)后72 d的100.16 ng·mL-1，之后又下降，在產(chǎn)后80 d時下降到50.76 ng·mL-1。第3發(fā)情期FSH濃度處于上升的趨勢，但是幅度很小，最終在產(chǎn)后85 d時濃度由75.26 ng·mL-1上升到產(chǎn)后100 d的79.28 ng·mL-1(圖9)。

圖9 不同時期的FSH濃度變化

產(chǎn)后恢復期23 d時LH濃度出現(xiàn)峰值，濃度為5 889.69 pg·mL-1，最高的LH濃度在產(chǎn)后34 d，為6 363.47 pg·mL-1；產(chǎn)后恢復期前期LH濃度呈下降狀態(tài)，在產(chǎn)后16 d時濃度下降到3 292.03 pg·mL-1，產(chǎn)后30 d出現(xiàn)第2次下降。第1發(fā)情期LH濃度出現(xiàn)1個峰值，且為在整個試驗過程中最高，達6 886.56 pg·mL-1，之后LH濃度持續(xù)下降，在產(chǎn)后58 d為4 107.66 pg·mL-1。第2發(fā)情期產(chǎn)后68 d LH濃度最高，為4 021.72 pg·mL-1，產(chǎn)后72 d LH濃度最小，為3 592.03 pg·mL-1。第3發(fā)情期LH濃度逐漸降低，產(chǎn)后91 d時濃度由產(chǎn)后85 d的3 163.13 pg·mL-1降到2 625.63 pg·mL-1，在產(chǎn)后100 d又上升到2 811.25 pg·mL-1。3個發(fā)情期的濃度總體呈現(xiàn)下降的趨勢(圖10)。

圖10 不同時期的LH濃度變化

產(chǎn)后恢復期PGE2的濃度先下降后上升，在產(chǎn)后16 d下降到69.17 pg·mL-1，但下降幅度不明顯，之后PGE2的濃度上升，產(chǎn)后23 d上升至175.83 pg·mL-1，產(chǎn)后34 d到達產(chǎn)后恢復期中最高，為177.51 pg·mL-1。第1個發(fā)情期產(chǎn)后41 d PGE2出現(xiàn)峰值，也是整個試驗過程中的峰值，為254.07 pg·mL-1，之后濃度下降。第2個發(fā)情期PGE2的濃度變化不大。第3個發(fā)情期PGE2濃度下降，產(chǎn)后100 d為59.79 pg·mL-1。3個發(fā)情期的濃度呈下降的趨勢(圖11)。由圖10和圖11可知LH和PGE2 2種激素的變化規(guī)律相似。

圖11 不同時期的PGE2濃度變化

產(chǎn)后恢復期GnRH濃度變化規(guī)律與LH和PGE2濃度相似，都是先下降再上升，產(chǎn)后16 d GnRH濃度下降到38.88 pg·mL-1，產(chǎn)后23 d又上升至84.21 pg·mL-1。產(chǎn)后34 d GnRH濃度最高，為87.91 pg·mL-1。3個發(fā)情期都出現(xiàn)了1個峰值，分別是在產(chǎn)后52、80和91 d，濃度分別是69.96、79.15和54.32 pg·mL-1(圖12)。

圖12 不同時期的GnRH濃度變化

2.3 不同生殖激素濃度的相關(guān)性

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，E2與PROG正相關(guān)，相關(guān)性極顯著；與FSH負相關(guān)，相關(guān)性顯著；與其他激素的相關(guān)性不顯著。PROG與FSH、LH、PGE2和GnRH均沒有顯著性相關(guān)關(guān)系。FSH與LH、PGE2和GnRH沒有顯著性相關(guān)關(guān)系。LH與PGE2正相關(guān)，相關(guān)性極顯著；與GnRH正相關(guān)，相關(guān)性顯著。PGE2與GnRH沒有顯著性相關(guān)關(guān)系(表1)。

表1 生殖激素的相關(guān)性

3 討論

3.1 不同時期各生殖激素濃度變化規(guī)律

生殖激素作用于各靶器官及靶細胞，影響繁殖活動[11]。E2主要用于泌乳，誘導發(fā)情，催產(chǎn)，調(diào)控卵泡的生長發(fā)育[12]、促進子宮內(nèi)膜的修復[13]、通過下丘腦反饋調(diào)節(jié)GnRH的含量[14]、治療胎衣不下等。PROG的作用是促進子宮發(fā)育、子宮內(nèi)膜的增生、維持妊娠[15]等，與E2協(xié)同作用于繁殖[16]。FSH的作用是促進卵泡發(fā)育、負反饋作用于GnRH的生成。LH的主要作用是促進黃體生成[17]。PGE2在繁育中的主要作用是溶解黃體[18]，在其他生命活動中也起作用，使支氣管平滑肌得以舒張，降低通氣阻力，還有降低血壓等一系列作用[19]。GnRH的作用是調(diào)節(jié)FSH和LH的生成，而FSH和LH又會負反饋調(diào)節(jié)GnRH的生成與釋放[20]。

產(chǎn)后恢復期E2出現(xiàn)最高值，為354.69 pg·mL-1，可能是因為要進行泌乳，所以E2的濃度達到最高，PROG在這一時期也出現(xiàn)了最高值為19.48 ng·mL-1，2種激素的最高值都出現(xiàn)在產(chǎn)后16 d。在試驗階段，4個時期的E2和PROG濃度有相同的變化規(guī)律，本結(jié)果與王宏娟[21]的研究結(jié)果相同，在發(fā)情期濃度先上升，之后下降，E2濃度最高值出現(xiàn)在產(chǎn)后恢復期，而PROG與E2極顯著正相關(guān)，所以濃度變化與E2相同；但在早期的研究報道E2與PROG的變化相反[22]，與本試驗的結(jié)果不同，可能是因為品種的原因。在4個時期中，F(xiàn)SH濃度總體變化規(guī)律先上升后下降，在第3發(fā)情期的濃度又上升，產(chǎn)后72 d的FSH濃度最高，為100.16 ng·mL-1。第1發(fā)情期的產(chǎn)后41 d，LH濃度最高，為6 886.56 pg·mL-1，在發(fā)情期前期濃度最高，之后濃度下降。劉楚沛[23]研究表明，在發(fā)情周期的15～18 d時出現(xiàn)峰值，間情期分泌的LH高于發(fā)情期，與本文的結(jié)果相同，但是張佰忠等[24]研究發(fā)現(xiàn)，湘西黃牛的LH濃度在發(fā)情當天濃度變大，與本文結(jié)果不同，分析原因可能品種不同。很多研究都是用PG進行同期發(fā)情處理，使家畜得以同期發(fā)情[25]，本文在試驗期間也進行了同期發(fā)情，本文的PGE2變化濃度范圍是59.79～254.07 pg·mL-1，相對范圍大，說明外源PG影響內(nèi)源PGE2的合成。本研究在發(fā)情周期前期PGE2出現(xiàn)峰值，濃度為254.07 pg·mL-1，說明在此時黃體溶解完畢，該進行發(fā)情，所以研究結(jié)果是正確的。陳陽[26]在2019年研究發(fā)現(xiàn)，湖羊血液主要的生化指標與生殖激素在圍產(chǎn)期尤其是在分娩前后其變化比較顯著，本試驗產(chǎn)后恢復期濃度變化相對發(fā)情周期大，可以判定與其結(jié)果相同。在產(chǎn)后恢復期GnRH出現(xiàn)2個峰值，分別在產(chǎn)后23和34 d，產(chǎn)后34 d的濃度最高。第1發(fā)情期出現(xiàn)1個峰值，在產(chǎn)后52 d，第2發(fā)情期產(chǎn)后80 d出現(xiàn)峰值，第3發(fā)情期也出現(xiàn)了峰值，在產(chǎn)后91 d，在試驗期間GnRH共出現(xiàn)5個峰值。

3.2 生殖激素的相關(guān)性分析

研究表明，E2與卵泡波緊密相關(guān)，在E2下降時，優(yōu)勢卵泡逐漸增長[27]，而此時FSH的濃度開始增長[28]，與本文結(jié)果相同，E2與FSH顯著負相關(guān)。Evans等[29]的研究表明，卵巢雄激素和雌二醇在卵泡發(fā)育波期間對FSH的分泌起關(guān)鍵作用，并且優(yōu)勢卵泡在卵泡波動過程中對循環(huán)雌二醇和雄激素的波動也起重要的作用。有研究表明，P4與FSH和LH負相關(guān)[30]，負反饋調(diào)節(jié)FSH和LH的釋放[31]，本試驗的PROG與FSH負相關(guān)，與研究報道的相同，但是PROG與LH正相關(guān)，與其得出的結(jié)果相反，具體原因還需要進一步進行研究。Bao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在牛的每個卵泡波出現(xiàn)之前，F(xiàn)SH都會出現(xiàn)暫時性的上升，F(xiàn)SH在發(fā)情期出現(xiàn)的第1個峰值在LH峰值出現(xiàn)之后，與本研究的結(jié)果相同，本文FSH出現(xiàn)的峰值在LH峰值之后，但2個峰值出現(xiàn)時間相差較大，可能是因為采樣時間間隔太大，導致未能觀察到細微的變化。研究表明，LH對PGE2有影響，在LH刺激后的15 d，育成母羊的子宮內(nèi)膜只分泌PGE2，由此表明，LH可能參與了母羊早孕期黃體溶解的預防，影響PGE2的分泌[33]，這也說明LH與PGE2正相關(guān)，與本文的結(jié)果相同，本文得出LH與PGE2極顯著正相關(guān)。LH與GnRH顯著正相關(guān)，研究表明，GnRH促進LH和FSH的分泌[34]。姚路連[35]研究表明，P4和FSH極顯著負相關(guān)，本文的FSH與PROG負相關(guān)，但是不顯著。張澤林[36]檢測LH對黃體細胞GnRH的分泌得知，一定濃度的LH會提高黃體GnRH的表達水平，本研究中的FSH與GnRH是負相關(guān)的關(guān)系，但是LH與其是顯著正相關(guān)的關(guān)系，與張澤林研究的結(jié)果相似。本文的GnRH在產(chǎn)后恢復期的變化規(guī)律與LH及PGE2相似，是因為GnRH作用于LH的釋放，而LH又影響著PGE2的濃度變化，所以3者前期的變化規(guī)律相同。GnRH在4個時期的濃度變化范圍為37.19～87.91 pg·mL-1，在產(chǎn)后恢復期的變化總體是升高的。在本試驗中的GnRH與LH是顯著正相關(guān)，說明GnRH影響著LH的濃度。

4 小結(jié)

在產(chǎn)后恢復期E2、PROG、LH、GnRH的濃度大于3個發(fā)情期的濃度，第1發(fā)情期PGE2濃度最高，第2發(fā)情期FSH濃度最高。產(chǎn)后恢復期和第3發(fā)情期LH濃度相關(guān)性顯著，其他激素各時期相關(guān)性不顯著，說明LH濃度變化影響著西門塔爾牛配種成功的幾率，可以作為西門塔爾牛配種成功與否的標準。不同時期各生殖激素變化規(guī)律不同，激素之間具有相關(guān)性，可以作為之后西門塔爾肉牛研究的基礎(chǔ)，也可以為西門塔爾肉牛的繁殖提供參考。