段新崇，魏彥輝，李　陽(yáng)，李相運(yùn)，周榮艷，錫建中

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001)

?

小尾寒羊間情期和發(fā)情期microRNAs差異表達(dá)分析

段新崇，魏彥輝，李陽(yáng)，李相運(yùn)，周榮艷*，錫建中

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001)

摘要：本研究通過(guò)構(gòu)建和分析小尾寒羊間情期和發(fā)情期卵巢組織microRNA(miRNA)表達(dá)譜，篩選兩個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的microRNAs，為研究microRNA調(diào)控小尾寒羊繁殖過(guò)程提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。利用活體手術(shù)法在發(fā)情期(第1天)和間情期(第13天)分別采集一側(cè)卵巢。從卵巢中提取總RNA，利用illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)獲取RNA數(shù)據(jù)，對(duì)表達(dá)譜和差異表達(dá)microRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNAs在小尾寒羊卵巢中表達(dá)水平。結(jié)果，成功地構(gòu)建出小尾寒羊間情期和發(fā)情期microRNA的表達(dá)譜，oar-miR-99a和oar-miR-143分別是間情期和發(fā)情期表達(dá)量最高的microRNA，并篩選出在兩個(gè)時(shí)期間3個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNAs，分別為oar-miR-200a、oar-miR-200b和oar-miR-200c。利用qRT-PCR對(duì)隨機(jī)選擇的2個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，其表達(dá)水平和RNA-Seq分析結(jié)果一致。microRNA表達(dá)譜為后續(xù)的綿羊卵巢microRNA研究提供更詳盡的信息。結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)及通路富集分析，推測(cè)差異表達(dá)的microRNAs是通過(guò)代謝和免疫途徑調(diào)控卵巢周期性活動(dòng)。

關(guān)鍵詞：小尾寒羊；間情期；發(fā)情期；卵巢；microRNA

microRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在哺乳動(dòng)物的卵巢、輸卵管、子宮、胎盤(pán)等繁殖組織器官中廣泛表達(dá)[1-3]。它通過(guò)與靶mRNA特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用，從而參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等一系列生物學(xué)過(guò)程，而這些生物學(xué)過(guò)程正是卵泡發(fā)生、排卵以及黃體生成所必須的過(guò)程[4]。研究發(fā)現(xiàn)microRNA參與動(dòng)物的多項(xiàng)繁殖活動(dòng)。首先，microRNA影響激素合成：如對(duì)體外培養(yǎng)的人顆粒細(xì)胞進(jìn)行miR-15a、Let-7b、Let-7c、miR-17-3p等36種microRNAs的轉(zhuǎn)染，孕酮釋放量提高了1.3～2.0倍；miR-16、miR-24、miR-25、miR-122等10種microRNAs轉(zhuǎn)染使孕酮釋放量減少了5倍以上；miR-15a、miR-24、miR-25、miR-26a等51種microRNAs對(duì)雌激素分泌有抑制作用，最高達(dá)4.5倍[5]。在豬有腔卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中，顆粒細(xì)胞中的miR-378表達(dá)水平上升，抑制芳香酶基因表達(dá)和雌激素的分泌[6]。其次，microRNA調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞、卵泡、黃體發(fā)育。調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡的microRNAs主要有miR-145、miR-23a和miR-26b，其中miR-145通過(guò)靶作用于激活素受體IB和細(xì)胞周期蛋白D2基因而抑制顆粒細(xì)胞增殖[7]。LH 峰后顆粒細(xì)胞內(nèi)的miR-21、miR-212表達(dá)量增加，miR-21有防止排卵卵泡的顆粒細(xì)胞在黃體化過(guò)程中發(fā)生凋亡的作用，其調(diào)控的機(jī)理尚不清楚[8]；miR-212能夠上調(diào)受體轉(zhuǎn)錄因子CTBP-1在小鼠顆粒細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平[9]。F.Muramatsu等發(fā)現(xiàn)miR-125b、miR-145、miR-31、miR-503和miR-21在反芻動(dòng)物卵泡與黃體中表達(dá)差異顯著[10]。最近R.Di等首次確定了灘羊非發(fā)情季節(jié)卵巢microRNAs表達(dá)譜，表達(dá)譜中共202個(gè)microRNAs，包括63個(gè)已知的，136個(gè)保守的和3個(gè)新預(yù)測(cè)的microRNAs，miR-n-142是非發(fā)情季節(jié)表達(dá)最豐富的microRNA，其靶基因主要富集在氧化磷酸化、甘油脂代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)通路中[11]?？梢?jiàn)microRNAs在雌性哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中具有極其重要的作用。

小尾寒羊是冀、魯、豫、蘇、皖等地的優(yōu)良品種，在繁殖性能中具有較為突出的表現(xiàn)，如成熟早、四季發(fā)情、產(chǎn)羔率高。其間情期與發(fā)情期卵巢經(jīng)過(guò)了一系列變化過(guò)程，并最終決定了高繁殖率。建立小尾寒羊間情期與發(fā)情期microRNAs的表達(dá)譜并篩選兩個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的microRNAs，為研究microRNAs在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育與排卵生物學(xué)過(guò)程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選擇3只經(jīng)產(chǎn)小尾寒羊母羊，用公羊試情判斷母羊發(fā)情。利用活體外科手術(shù)法在3只母羊的間情期和發(fā)情期(間隔12 d)分別采取一側(cè)卵巢，立即投入液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃保存。

1.2總RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，China)，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。并對(duì)樣本總RNA進(jìn)行以下各項(xiàng)質(zhì)量檢測(cè)：利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解程度以及是否有污染；RNA純度由NanoPhotometer(IMPLEN，CA，USA)進(jìn)行檢測(cè)；Qubit?2.0(Life Technologies，CA，USA)檢測(cè)RNA濃度；最后使用Agilent(Agilent Technologies，CA，USA)對(duì)RNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)。

樣品檢測(cè)合格后，小RNA(sRNA)文庫(kù)及高通量測(cè)序由北京諾禾致源生物信息有限公司完成。每個(gè)樣品需3 μg的總RNA，使用Small RNA Sample Pre Kit(NEB，USA)構(gòu)建文庫(kù)，利用sRNA的3′及5′端特殊結(jié)構(gòu)，以總RNA為起始樣品在sRNA兩端加接頭并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，PAGE膠電泳分離目標(biāo)DNA片段，切膠回收得到的即為cDNA文庫(kù)。按照有效濃度及目標(biāo)數(shù)據(jù)量的要求pooling后進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序，得到的序列原始數(shù)據(jù)(Raw Data)用于基本數(shù)據(jù)的分析。

1.3生物信息學(xué)分析鑒定sRNA

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量、去除接頭、去除污染、去除堿基信息不明確的序列，得到干凈的的序列；對(duì)sRNA的長(zhǎng)度分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，長(zhǎng)度分布峰可以幫助我們判斷sRNA的種類(lèi)，篩選一定長(zhǎng)度范圍的sRNA進(jìn)行后續(xù)分析；用bowtie軟件將sRNA定位到參考序列上，將序列比對(duì)到RepeatMasker和Rfam本物種的數(shù)據(jù)庫(kù)，去除sRNAs中相應(yīng)的重復(fù)序列以及rRNA、tRNA、SnRNA和SnoRNA等非編碼的sRNA；剩余的sRNA對(duì)比到miRBase20.0尋找到已知的microRNAs；運(yùn)用mirdeep2軟件預(yù)測(cè)新的microRNAs；對(duì)各樣本中已知和新的microRNAs進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行表達(dá)量TPM歸一化處理；將microRNAs表達(dá)水平分析中得到的readcount數(shù)據(jù)，采用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq[12-13]進(jìn)行分析，從差異倍數(shù)(Fold change)和校正后的顯著水平(q value<0.01)進(jìn)行評(píng)估，對(duì)差異microRNAs進(jìn)行篩選。本研究進(jìn)行生物信息分析時(shí)所參考的數(shù)據(jù)庫(kù)和分析程序信息見(jiàn)表1。

表1　生物信息學(xué)分析軟件

1.4real-time PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNAs

對(duì)小尾寒羊兩個(gè)時(shí)期內(nèi)顯著差異表達(dá)的oar-miR-200a和oar-miR-200b進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。以U6基因?yàn)閮?nèi)參，microRNA及內(nèi)參基因探針見(jiàn)表2。使用microRNA第一條鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，China) 合成的cDNA作為qRT-PCR的模板。PCR反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA、40 μmol·L-1正反引物、10 μL的SYBR Premix Ex Taq(寶生物工程有限公司，大連)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共14個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。相對(duì)表達(dá)量結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

表2　microRNAs定量檢測(cè)的引物序列

2結(jié)果

2.1純化原始序列及sRNA序列長(zhǎng)度分布

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)去除低質(zhì)量、接頭、污染等過(guò)程后得到干凈序列(clean reads)，發(fā)情期(PXW)和間情期(DXW)分別得到clean reads為11 467 290和10 667 271個(gè)。sRNA長(zhǎng)度分布主要是21～23 bp，測(cè)序數(shù)據(jù)中間情期和發(fā)情期長(zhǎng)度為22 bp的序列分別占44.55%和43.49%(圖1)。統(tǒng)計(jì)兩樣品間公共序列和特有序列的種類(lèi)(uniq)及數(shù)量(total)，兩個(gè)品種間公共序列的種類(lèi)僅占全部序列的13.05%，而公共序列的數(shù)量卻占全部數(shù)量的93.39%(圖2)。

2.2sRNA與參考序列進(jìn)行比對(duì)

使用Bowtie將長(zhǎng)度篩選后的sRNA reads定位到參考序列上，分析sRNA在參考序列上的分布情況，可以看出大部分的sRNA都可以匹配到參考序列上，間情期和發(fā)情期沒(méi)有匹配上的sRNA分別僅占12.03%和18.76%(表3)。

2.3microRNAs在間情期和發(fā)情期的表達(dá)譜分析

間情期與發(fā)情期卵巢組織sRNA與miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到匹配上的已知microRNAs分別有129、135個(gè)。兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量經(jīng)TPM標(biāo)準(zhǔn)化處理后，排在前10位的microRNAs相同(圖3)，分別為oar-miR-143、oar-miR-21、oar-miR-99a、oar-miR-26a、oar-miR-148a、oar-miR-10b、oar-let-7i、oar-let-7f、oar-let-7g、oar-miR-199a-3p。而間情期和發(fā)情期表達(dá)量TPM值最高的microRNA分別是oar-miR-99a(173 266)和oar-miR-143(187 028)。

表3　與參考基因組比對(duì)信息統(tǒng)計(jì)表

圖1　小RNA長(zhǎng)度分布Fig.1　Length distribution of small RNA sequencing

A.兩個(gè)時(shí)期公共及特有序列種類(lèi) (Uniq sRNA)；B.兩個(gè)時(shí)期公共及特有序列數(shù)量統(tǒng)計(jì)(Total sRNA)A.Venn chart for uniq sRNAs in 2 periods；B.Venn chart for total sRNAs in 2 periods圖2　兩個(gè)時(shí)期公共及特有的序列數(shù)量及種類(lèi)Fig.2　Venn chart for total and uniq sRNAs in 2 periods

圖3　小尾寒羊間情期和發(fā)情期卵巢組織前20位的microRNAs表達(dá)水平柱形圖Fig.3　Bar diagram of top 20 microRNAs expressed in estrus and diestrus ovary in the Small Tailed Han sheep

2.4差異表達(dá)microRNAs的篩選

小尾寒羊卵巢組織microRNAs表達(dá)量經(jīng)TPM標(biāo)準(zhǔn)化后，獲得3個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNAs，在發(fā)情期較間情期全部表達(dá)下調(diào)(log2Fold change<-1)(圖4)，分別是oar-miR-200a由403.6下調(diào)至120.4；oar-miR-200b由119.3下調(diào)至26.7；oar-miR-200c由22.4下調(diào)至3.1，三者均屬于miR-200家族。

方塊表示顯著差異表達(dá)的microRNAs (log2Fold change<-1，p value<0.01，q value<0.01)square shape indicate significant difference in expression of microRNAs(log2Fold change<-1，p value<0.01，q value<0.01)圖4　顯著差異表達(dá)microRNAs分析火山圖Fig.4　The volcano plot of significant differentially expressed microRNAs

2.5新microRNAs的預(yù)測(cè)

使用microRNA預(yù)測(cè)軟件miREvo[12]和mirdeep2[13]進(jìn)行新microRNA的分析，截取一定長(zhǎng)度sRNA比對(duì)上的參考序列，通過(guò)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及Dicer酶切位點(diǎn)信息、能量等特征進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)樣品中新microRNA，此次測(cè)序中小尾寒羊間情期和發(fā)情期共發(fā)現(xiàn)68個(gè)新microRNAs：間情期57個(gè)，發(fā)情期59個(gè)。Novel_67在兩個(gè)時(shí)期中表達(dá)量TPM值最高，分別是201.4和200.9(圖5)。

圖5　小尾寒羊間情期和發(fā)情期卵巢組織新microRNAs表達(dá)水平柱形圖Fig.5　Bar diagram of novel microRNAs expressed in estrus and diestrus ovary in the Small Tailed Han sheep

2.6qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

在小尾寒羊間情期和發(fā)情期卵巢組織顯著差異表達(dá)的microRNAs中選取oar-miR-200a和oar-miR-200b進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證。結(jié)果表明oar-miR-200a和oar-miR-200b在小尾寒羊卵巢中皆有表達(dá)(表4)，并且二者在發(fā)情期較間情期均表達(dá)下調(diào)，這與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果基本一致。

表4　qRT-PCR與RNA-Seq結(jié)果比較

2.7差異microRNAs的靶基因預(yù)測(cè)和 GO 功能注釋

根據(jù)已有數(shù)據(jù)，oar-miR-200a、oar-miR-200b、oar-miR-200c預(yù)測(cè)得到的靶基因個(gè)數(shù)分別為：540、583和687個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)合圖6和在線(xiàn)分析結(jié)果可知，在細(xì)胞組分分類(lèi)中，差異表達(dá)microRNAs的靶基因絕大部分參與形成細(xì)胞成分(占70%)，其次參與形成細(xì)胞內(nèi)組分(占35%)；在分子功能分類(lèi)中，絕大部分靶基因參與連接分子類(lèi)(占71%)，其次是催化活性分子類(lèi)(占55%)；而在生物學(xué)過(guò)程分類(lèi)中，參與有機(jī)物代謝過(guò)程的靶基因較多(占52%)，然后是初級(jí)代謝過(guò)程(占51%)。

2.8差異microRNAs靶基因KEGG富集分析

在生物體內(nèi)不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過(guò)通路顯著性富集能確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對(duì)差異microRNAs靶基因進(jìn)行KEGG富集分析(P<0.05，F(xiàn)DR<0.4)，結(jié)果表明，差異microRNAs的靶基因在免疫、凝血、脂肪代謝以及糖代謝等19個(gè)通路達(dá)到顯著富集水平。X.Y.Miao等對(duì)不同發(fā)情周期小尾寒羊和道賽特羊的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)KEGG通路分析提出代謝、免疫等途徑可能調(diào)控家畜繁殖力[14]，并且繁殖力與能量平衡、代謝關(guān)系密切[15-16]，我們篩選出4條與卵巢繁殖活動(dòng)關(guān)系較大的通路分別是：脂肪酸代謝通路、I型糖尿病通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞粘附分子通路(表5)。差異表達(dá)microRNAs的靶基因及參與的KEGG通路如圖7所示，所有差異表達(dá)microRNAs通過(guò)相同靶基因FGN、C1S參與補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而且通過(guò)相同靶基因CD274、ITGA9、ITGA6、NEO1參與細(xì)胞粘附分子通路；DYA與OVAR-DQA2作為oar-miR-200c和oar-miR-200b共同的靶基因同時(shí)參與細(xì)胞粘附分子和I型糖尿病通路，并且oar-miR-200c和oar-miR-200b還通過(guò)共同的靶基因ACOX1、CPT1A、OXSM、SCD和ACACB參與脂肪酸代謝通路(圖7)。

1.DNA復(fù)制RNA合成；2.DNA復(fù)制；3.DNA代謝過(guò)程；4.生物合成過(guò)程；5.細(xì)胞生物合成過(guò)程；6.有機(jī)物質(zhì)生物合成的過(guò)程；7.細(xì)胞大分子生物合成過(guò)程：8.大分子生物合成過(guò)程；9.核酸代謝過(guò)程；10.氮的化合物代謝過(guò)程；11.初級(jí)代謝過(guò)程；12.細(xì)胞代謝過(guò)程；13.蛋白質(zhì)N-鏈糖基化；14.含堿基化合物代謝；15.細(xì)胞氮化合物代謝；16.雜環(huán)代謝過(guò)程；17.細(xì)胞大分子代謝過(guò)程；18.有機(jī)物質(zhì)代謝過(guò)程；19.有機(jī)環(huán)狀化合物代謝過(guò)程；20.細(xì)胞芳香族化合物代謝；21.高爾基體運(yùn)輸復(fù)合體；22.細(xì)胞組分；23.胞質(zhì)部分；24.有膜細(xì)胞器；25.細(xì)胞內(nèi)的有膜細(xì)胞器；26.細(xì)胞；27.細(xì)胞部分；28.細(xì)胞外區(qū)域；29.細(xì)胞外部分；30.線(xiàn)粒體；31.細(xì)胞質(zhì)；32.高爾基體部分；33.細(xì)胞器；34.細(xì)胞內(nèi)；35.細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器；36.線(xiàn)粒體膜部分；37.RNA-直接DNA聚合酶的活動(dòng)；38.DNA聚合酶活動(dòng)；39.核酸轉(zhuǎn)移酶活性；40.RNA結(jié)合；41.轉(zhuǎn)移酶活性；42.催化活性；43.核酸結(jié)合；44.β-1，4-甘露糖基-糖蛋白 4 -β-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性；45.轉(zhuǎn)移酶活性；46.乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶活性；47.雜環(huán)化合物結(jié)合；48.有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合；49.UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性；50.戊糖基轉(zhuǎn)移酶活性；51.一碳基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶活性；52.結(jié)合；53.受體結(jié)合1.RNA-dependent DNA replication；2.DNA replication；3.DNA metabolic process；4.Biosynthetic process；5.Cellular biosynthetic process；6.Organic substance biosynthetic process；7.Cellular macromolecule biosynthetic process；8.Macromolecule biosynthetic process；9.Nucleic acid metabolic process；10.Nitrogen compound metabolic process；11.Primary metabolic process；12.Cellular metabolic process；13.Protein N-linked glycosylation；14.Nucleobase-containing compound metabolic；15.Cellular nitrogen compound metabolic；16.Heterocycle metabolic process；17.Cellular macromolecule metabolic process；18.Organic substance metabolic process；19.Organic cyclic compound metabolic process；20.Cellular aromatic compound metabolic；21.Golgi transport complex；22.Cellular component；23.Cytoplasmic part；24.Membrane-bounded organelle；25.Intracellular membrane-bounded organelle；26.Cell；27.Cell part；28.Extracellular region；29.Intracellular part；30.Mitochondrion；31.Cytoplasm；32.Golgi apparatus part；33.Organelle；34.Intracellular；35.Intracellular organelle；36.Mitochondrial membrane part；37.RNA-directed DNA polymerase activity；38.DNA polymerase activity；39.Nucleotidyl transferase activity；40.RNA binding；41.Transferase activity；42.Catalytic activity；43.Nucleic acid binding；44.Beta-1，4-mannosylglycoprotein 4-beta-N-acetylglucosaminyltransferase activity；45.Transferase activity，transferring hexosyl groups；46.Acetylglucosaminyl transferase activity；47.Heterocyclic compound binding；48.Organic cyclic compound binding；49.UDP-glycosyltransferase activity；50.Transferase activity，transferring pentosyl groups；51.Transferase activity，transferring one-carbon groups；52.Binding；53.Receptor binding圖6　差異microRNAs靶基因的 GO 功能分類(lèi)圖Fig.6　Gene Ontology annotation plot for target genes of microRNAs differentially expressed

表5　4個(gè)顯著富集的KEGG 代謝途徑

圖7　差異表達(dá)microRNAs靶基因與4個(gè)富集KEGG通路關(guān)系圖Fig.7　The relationship between target genes of differential expression of microRNAs and the 4 enriched KEGG pathways

3討論

繁殖性狀是綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，而繁殖性狀是受多基因控制的，遺傳力低，傳統(tǒng)的選擇方法對(duì)其遺傳進(jìn)展的改良非常緩慢，培育新的高繁殖率品種是相當(dāng)繁瑣甚至是不可能實(shí)現(xiàn)的。小尾寒羊是世界上具有非季節(jié)性發(fā)情和多胎特性的高繁殖率綿羊品種之一，研究其microRNA對(duì)卵泡發(fā)育和排卵的調(diào)控機(jī)制，開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇，為解決這一問(wèn)題提供了新的方向。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)小尾寒羊卵巢組織不同時(shí)期microRNA研究，豐富了綿羊microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，發(fā)情期與間情期共有188種microRNAs表達(dá)：其中164種microRNAs在兩個(gè)時(shí)期共同表達(dá)，9種在間情期卵巢特異表達(dá)，15種在發(fā)情期卵巢中特異表達(dá)。間情期與發(fā)情期表達(dá)譜中表達(dá)量最多的microRNA分別是miR-99a、miR-143，除此之外一些表達(dá)豐富的microRNAs如miR-26a、let-7、miR-21，在人、牛[17]、豬[18]、成年和新生小鼠[19]的卵巢內(nèi)表達(dá)也是非常豐富的。這些保守的microRNAs在哺乳動(dòng)物生殖階段高表達(dá)，說(shuō)明它們?cè)诼殉补δ苤邪缪葜浅Ｖ匾慕巧Ｔ谝酝难芯恐袑?duì)這些高表達(dá)microRNA的部分功能進(jìn)行了研究與分析：miR-21確定能夠促進(jìn)排卵期卵泡細(xì)胞的存活[20]，而miR-143是小鼠原始卵泡形成的關(guān)鍵[21]以及l(fā)et-7b被證明是黃體正常發(fā)育過(guò)程中所必須的[22]。miR-99a的高表達(dá)結(jié)果和胎牛與小鼠卵巢microRNA克隆分析研究中miR-99a表達(dá)豐富相一致[19，23]。此外，KEGG通路對(duì)microRNA的靶基因富集，這對(duì)卵巢功能分析也很重要。例如，miR-143在促性腺激素釋放激素信號(hào)通路和孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟途徑上顯著富集，這樣通過(guò)內(nèi)分泌功能、卵泡發(fā)育影響卵巢活動(dòng)[11]。另外，let-7家族的靶基因參與細(xì)胞凋亡、Wnt信號(hào)通路和C21甾體激素代謝途徑，這對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、黃體形成和退化很重要[24]。以上研究均證明了這些保守的高表達(dá)microRNAs在動(dòng)物卵巢功能中的重要作用，同時(shí)也是因?yàn)檫@些作用才使得這些microRNAs在此次卵巢測(cè)序中高表達(dá)，與本試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

本研究中，間情期和發(fā)情期卵巢差異表達(dá)的microRNAs(oar-miR-200a、oar-miR-200b、oar-miR-200c)均屬于miR-200家族。根據(jù)GO以及KEGG通路分析得到，差異表達(dá)microRNAs靶基因參與免疫與代謝過(guò)程與小尾寒羊卵巢周期性活動(dòng)有關(guān)：細(xì)胞粘附分子通路，參與卵泡與黃體顆粒細(xì)胞的凋亡[25-26]；補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)則是因?yàn)榕怕押舐雅萜屏岩鹇殉驳囊幌盗袘?yīng)答反應(yīng)[27-28]；而脂肪酸代謝通路中靶基因富集，可能是由于兩個(gè)時(shí)期卵巢內(nèi)激素水平的變化對(duì)應(yīng)的結(jié)果；糖代謝通路推測(cè)與兩個(gè)時(shí)期卵巢活動(dòng)如卵泡發(fā)育、破裂所需的能量代謝有關(guān)。而以往對(duì)miR-200家族的功能研究多見(jiàn)于腫瘤方面，但是探索其對(duì)動(dòng)物繁殖方面的作用也是很有意義的。ZEB1作為miR-200a、miR-200b、miR-200c共同的預(yù)測(cè)靶基因，在卵巢的表達(dá)模型中直接參與調(diào)節(jié)卵泡的作用，切除垂體的倉(cāng)鼠卵巢內(nèi)ZEB1 mRNA顯著增加，而ZEB1蛋白卻顯著減少，導(dǎo)致mRNA和蛋白差異表達(dá)的原因正是由于miR-200轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)作用[29]。H.Hasuwa等發(fā)現(xiàn)，缺乏miR-200b和miR-429的雌性小鼠不排卵，而miR-200b和miR-429通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1的表達(dá)調(diào)節(jié)小鼠繁殖過(guò)程[30]。在其他的報(bào)道中，miR-200b在小鼠的子宮、肌肉、腎中表達(dá)量較高，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)驗(yàn)證其靶基因，推測(cè)miR-200b通過(guò)與靶基因Fog2的相互作用參與小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程[31]。另外，miR-200a在懷孕6天和4天的小鼠子宮內(nèi)膜中相比較表達(dá)量顯著下調(diào)，表明miR-200a在胚胎著床前后對(duì)子宮內(nèi)膜起到重要的調(diào)節(jié)作用[32]。

4結(jié)論

通過(guò)成功地構(gòu)建小尾寒羊間情期和發(fā)情期microRNA的表達(dá)譜，為后續(xù)的綿羊microRNA研究提供更多更詳盡的序列信息。篩選出兩個(gè)時(shí)期差異表達(dá)的microRNAs，結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)及通路富集分析結(jié)果，推測(cè)差異表達(dá)的microRNAs通過(guò)參與代謝與免疫過(guò)程調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育進(jìn)而影響卵巢的周期性活動(dòng)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]HU S J，REN G，LIU J L，et al.MicroRNA expression and regulation in mouse uterus during embryo implantation[J].JBiolChem，2008，283(34)：23473-23484.

[2]CARLETTI M Z，CHRISTENSON L K.MicroRNA in the ovary and female reproductive tract[J].JAnimSci，2009，87(14)：29-38.

[3]徐盛玉，王定越，吳德.MicroRNA及其對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(6)：747-753.

XU S Y，WANG D Y，WU D.Effects of MicroRNA on the Mammalian Reproduction[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2011，42(6)：747-753.(in Chinese)

[4]CHRISTENSON L K.MicroRNA control of ovarian function[J].AnimReprodSci， 2010，7(3)：129-133.

[5]SIROTKIN A V，OVCHARENKO D，GROSSMANN R，et al.Identification of microRNAs controlling human ovarian cell steroidogenesis via a genome-scale screen[J].JCellPhysiol，2009，219(2)：415-420.

[6]XU S，LINHER-MELVILLE K，YANG B B，et al.Micro-RNA378 (miR-378) regulates ovarian estradiol production by targeting aromatase[J].Endocrinology，2011，152(10)：3941-3951.

[7]YAN G J，ZHANG L，F(xiàn)ANG T，et al.MicroRNA-145 suppresses mouse granulosa cell proliferation by targeting activin receptor IB[J].FEBSLett，2012，586(19)：3263-3270.

[8]DAVIS B N，HILYARD A C，LAGNA G，et al.SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation[J].Nature， 2008，454(7200)：56-61.

[9]VO N，KLEIN M E，VARLAMOVA O，et al.A cAMP-response element binding protein-induced microRNA regulates neuronal morphogenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(45)：16426-16431.

[10]MURAMATSU F，KIDOYA H，NAITO H，et al.microRNA-125b inhibits tube formation of blood vessels through translational suppression of VE-cadherin[J].Oncogene，2013，32(4)：414-421.

[11]DI R，HE J，SONG S，et al.Characterization and comparative profiling of ovarian microRNAs during ovine anestrus and the breeding season[J].BMCGenomics，2014，15(1)：899.

[12]WEN M，SHEN Y，SHI S，et al.miREvo：An integrative microRNA evolutionary analysis platform for next-generation sequencing experiments[J].BMCBioinformatics，2012，13(1)：140.

[13]FRIEDLANDER M R，MACKOWIAK S D，LI N，et al.miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades[J].NucleicAcidsRes，2011，40(1)：37-52.

[14]MIAO X Y，LUO Q M，QIN X Y.Genome-wide transcriptome analysis of mRNAs and microRNAs in Dorset and Small Tail Han sheep to explore the regulation of fecundity[J].MolCellEndocrinol，2015，15(402)：32-42.

[15]BARTEL D P.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions[J].Cell，2009，136(2)：215-233.

[16]VALEGGIA C，EILLSON P T.Interactions between metabolic and reproductive functions in the resumption of postpartum fecundity[J].AmJHumBiol，2009，21(4)：559-566.

[17]HOSSAIN M M，GHANEM N，HOELKER M，et al.Identification and characterization of miRNAs expressed in the bovine ovary[J].BMCGenomics，2009，10(1)：443.

[18]LI M Z，LIU Y K，WANG T，et al.Repertoire of porcine microRNAs in adult ovary and testis by deep sequencing[J].IntJBiolSci， 2011，7(7)：1045-1055.

[19]MISHIMA T，TAKIZAWA T，LUO S S，et al.MicroRNA (miRNA) cloning analysis reveals sex differences in miRNA expression profiles[J].Reproduction，2008，136(6)：811-822.

[20]CARLETTI M Z，F(xiàn)IEDLER S D，CHRISTENSON L K.MicroRNA 21 blocks apoptosis in mouse periovulatory granulosa cells[J].BiolReprod，2010，83(2)：286-295.

[21]ZHANG J F，JI X W，ZHOU D D，et al.miR-143 is critical for the formation of primordial follicles in mice[J].FrontBiosci，2012(1)，18：588-597.

[22]OTSUKA M，ZHENG M，HAYASHI M，et al.Impaired microRNA processing causes corpus luteum insufficiency and infertility in mice[J].JClinInvest，2008，118(5)：1944-1954.

[23]TRIPURANI S K，XIAO C，SALEM M，et al.Cloning and analysis of fetal ovary microRNAs in cattle[J].AnimReprodSci，2010，120(1)：16-22.

[24]ROUSH S，SLACK F J.The let-7 family of microRNAs[J].TrendsCellBiol，2008，18(10)：505-516.

[25]MAKRIGIANNAKIS A，COUKOS G，CHRISTOFIDOU-SOLOMIDOU M，et al.N-cadherin-mediated human granulosa cell adhesion prevents apoptosis：a role in follicular atresia and luteolysis?[J].AmJPathol，1999，154(5)：1391-1406.

[26]MORA J M，F(xiàn)ENWICK M A，CASTLE L，et al.Characterization and significance of adhesion and junction-related proteins in mouse ovarian follicles[J].BiolReprod，2012，86(5)：153.

[27]AMBEKER A S，NLIRUJOG R S，SRIKANTH S M，et al.Proteomic analysis of human follicular fluid：a new perspective towards understanding folliculogenesis[J].JProteomics，2013，87(7)：68-77.

[28]EBISCH I M W，THOMAS C M G，WETZELS A M M，et al.Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility[J].FertilSteril，2008，90(6)：2340-2350.

[29]WANG C，ROY S K.Gonadotropins and steroids regulation of ZEB1 expression in the hamster ovary[J].BiolReprod，2011，85(1 Supplement)：661.

[30]HASUWA H，UEDA J，IKAWA M，et al.MiR-200b and miR-429 Function in mouse ovulation and are essential for female fertility[J].Science，2013，341(6141)：71-73.

[31]任紅艷，劉楠，陶聰，等.小鼠體型控制相關(guān)microRNA-200b(miR-200b)的表達(dá)譜及靶標(biāo)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，2013，21(1)：47-54.

REN H Y，LIU N，TAO C，et al.The expression profile and target gene analysis of mouse(Musmusculus) body size REgulation related microRNA-200b(miR-200b)[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2013，21(1)：47-54.(in Chinese)

[32]魯之中，陳雪梅，曾蘭，等.早孕小鼠胚胎著床前后子宮內(nèi)膜microRNAs差異表達(dá)[J].細(xì)胞生物學(xué)，2009，31(6)：848-852.

LU Z Z，CHEN X M，ZENG L，et al.The different expression of microRNAs in endometrium of early pregnant mouse during embryo implantation[J].ChineseJournalofCellBiology，2009，31(6)：848-852.(in Chinese)

(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.004

收稿日期：2015-11-13

基金項(xiàng)目：河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2015162)；河北省首批青年拔尖人才支持計(jì)劃(2013-2015)；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年學(xué)術(shù)帶頭人支持項(xiàng)目(2015-2017)

作者簡(jiǎn)介：段新崇(1989-)，女，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail: 15733202716@163.com *通信作者：周榮艷，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，Tel: 0312-7528451，E-mail: rongyanzhou@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S826；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1324-09

Analyzing the Differential Expression of microRNAs in Estrus and Diestrus of Small Tailed Han Sheep

DUAN Xin-chong，WEI Yan-hui，LI Yang，LI Xiang-yun，ZHOU Rong-yan*，XI Jian-zhong

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，HebeiAgriculturalUniversity，Baoding071001，China)

Abstract:To explore the theoretical basis of the microRNAs in regulating the reproductive process in Small Tail Han sheep，the ovarian microRNAs profiles were constructed and analyzed in estrus and diestrus.One ovary was collected with surgery method at estrus (the 1st day) and diestrus (the 13th day) from the same sheep，respectively.The RNA sequencing data were obtained with illumina Hiseq2000 sequencing platform.The expression profiles and differential expression of microRNAs were analyzed by bioinformatics method.The real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used for validating the differentially expressed microRNAs between the 2 periods in ovary.The microRNAs expression profiles of Small Tailed Han sheep was constructed in the period of estrus and diestrus in ovaries.The highest expression of microRNA was observed for oar-miR-99a and oar-miR-143 in the period of diestrus and estrus，respectively.Three microRNAs，oar-miR-200a，oar-miR-200b and oar-miR-200c，were significantly differentially expressed between estrus and diestrus.The expression level of 2 randomly selected microRNAs by qRT-PCR was the same as the result by RNA-seq data.These microRNAs expression profiles will be used to provide informations for further studying the microRNAs in sheep ovary.The differentially expressed microRNAs may regulate the ovarian periodic activity through the metabolism and immunity pathway by the analysis of predicted target genes and enriched pathways.

Key words:Small Tailed Han sheep；diestrus；estrus；ovary；microRNA