楊　彬，徐丹丹，孫志鵬，趙佳琦，閆博巍，李曉婷，武　瑞

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

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金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺成纖維細胞TGF-β1/Smad信號通路及其轉分化的影響

楊彬，徐丹丹，孫志鵬，趙佳琦，閆博巍，李曉婷，武瑞*

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

摘要：為探索金黃色葡萄球菌(S.aureus)對奶牛乳腺成纖維細胞(BMFB)TGF-β1/Smad信號通路及其轉分化的影響，用熱滅活金黃色葡萄球菌(0、104、105、106、107和108 CFU·mL-1)刺激BMFB，24 h后采用Real-time PCR 方法檢測TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的轉錄量，Western blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表達量。使用TGF-β1受體特異性抑制劑SB-431542預處理細胞，再用105 CFU·mL-1熱滅活金黃色葡萄球菌刺激細胞，24 h后采用Real-time PCR方法檢測α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的轉錄量，Western blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表達量，免疫熒光法檢測collagen-Ⅰ蛋白的表達量。結果顯示，不同濃度熱滅活金黃色葡萄球菌處理細胞的TGF-β1 mRNA的轉錄量顯著升高(P <0.05或P <0.01)，其中以105 CFU·mL-1刺激組的TGF-β1 mRNA的轉錄量最高。不同濃度滅活的金黃色葡萄球菌處理細胞的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達量均能顯著升高(P<0.05或P <0.01)，其中以105 CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達量最高。抑制劑SB-431542能夠極顯著抑制α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達量(P<0.01)。結果提示，金黃色葡萄球菌能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導奶牛乳腺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，本研究為揭示金黃色葡萄球菌性乳腺炎發(fā)生硬化的機制奠定基礎。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；奶牛乳腺成纖維細胞；α-SMA；collagen-Ⅰ；p-Smad2/3

金黃色葡萄球菌是引起臨床、亞臨床及慢性乳腺炎的最主要致病菌之一[1]。金黃色葡萄球菌性乳腺炎能夠導致乳腺成纖維細胞的異常增生，從而引起結締組織的增生，增生的結締組織向腺泡腔和導管腔內陷，引起乳腺導管的阻塞，最終受損的乳腺區(qū)域由于纖維變性而失去其泌乳功能[2]。器官纖維化的病理特征多表現為肌成纖維細胞的激活和細胞外基質的過度沉積，并最終導致器官正常結構的消失和功能永久性喪失[3-4]。細胞外基質是一種不可溶性蛋白質，包括各型膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白多糖等成分[5]。肌成纖維細胞是導致細胞外基質異常沉積的主要細胞，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是肌成纖維細胞特異的標志蛋白[6]。成纖維細胞并不是終末分化的細胞類型，而且保留了被激活后分化成纖維母細胞亞型的能力，肌成纖維細胞在正常組織器官中很少存在，當組織器官受到損傷后由其他類型細胞(主要是成纖維細胞)轉分化而來[7]。

研究證明轉化生長因子β1(TGF-β1)是促進組織器官纖維化最關鍵的細胞因子之一。在纖維變性疾病過程中，實質細胞和結締組織細胞合成并分泌TGF-β1，TGF-β1能夠誘導成纖維細胞等細胞轉分化為肌成纖維細胞，促進成纖維細胞及肌成纖維細胞細胞外基質的合成與沉積[8]。TGF-β1是通過其Ⅰ型受體(TGF-βRⅠ)和Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)及其下游Smad信號分子發(fā)揮作用，TGF-β1/活動素連續(xù)激活TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ，TGF-βRⅠ使細胞內質-核信號分子Smad2/3磷酸化，Smad2/3與Smad4結合后轉位到細胞核中參與基因調控[9-10]。

研究表明金黃色葡萄球菌誘導的慢性奶牛乳腺炎TGF-β1、受體TGF-βRⅠ及collagen-Ⅰ的表達顯著升高[11]。本課題組前期證明熱滅活的金黃色葡萄球菌能夠誘導奶牛乳腺成纖維細胞α-SMA及collagen-Ⅰ表達的升高，表明金黃色葡萄球菌可以使奶牛乳腺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，但是金黃色葡萄球菌誘導奶牛乳腺成纖維細胞發(fā)生轉分化的機制仍不清楚。因此，本研究擬從TGF-β1/Smad信號通路的角度探討其在奶牛乳腺纖維化中的作用，為防治金黃色葡萄球菌感染引起奶牛乳腺纖維化提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

BMFB由本實驗室分離純化鑒定并凍存；金黃色葡萄球菌由本實驗室保存；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量染料均購自TaKaRa公司；α-SMA抗體、GAPDH抗體均購自Abcam公司；collagen-Ⅰ抗體購自Novus公司；p-Smad2/3抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG-HRP、兔抗山羊IgG-HRP、FITC標記山羊抗兔IgG均購自北京中衫金橋公司；SB-431542購自Selleck公司；RIPA細胞裂解液購自康為世紀公司；蛋白酶抑制劑購自Sigma公司；預染蛋白質Marker購自Thermo公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學超敏顯色液均購自索萊寶公司。

1.2熱滅活菌液的制備

將凍存的S.aureus進行復蘇活化，采用平板計數法計算菌液濃度，用培養(yǎng)基將菌液稀釋為104、105、106、107、108CFU·mL-1，將菌液70 ℃溫育30 min滅活備用。

1.3熱滅活菌液刺激細胞

將凍存的3～4代BMFB用胰酶消化懸浮，計數后按1×105·mL-1的濃度接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長匯合鋪成單細胞層時，對照組以不加菌液的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理組加入不同濃度滅活菌液共培養(yǎng)24 h，分別收集各組細胞總RNA進行TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDHmRNA的熒光定量PCR檢測，分別收集各組細胞總蛋白質進行α-SMA、collagen-Ⅰ 、p-Smad2/3和GAPDH蛋白的Western blot檢測。在檢測抑制劑SB-431542預處理細胞后滅活菌液對細胞中α-SMA和collagen-Ⅰ表達的影響試驗中，將凍存的BMFB復蘇培養(yǎng)接種在細胞培養(yǎng)板，陰性對照組只加細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)及只加SB-431542(10 μmol·L-1)，陽性對照組加入105CFU·mL-1滅活菌液，TGF-β1受體特異性抑制劑處理組加入SB-431542(10 μmol·L-1)孵育1 h，然后加入105CFU·mL-1滅活菌液共24 h，分別收集各組細胞總RNA進行α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDHmRNA的熒光定量PCR檢測，分別收集各組細胞總蛋白質進行α-SMA、collagen-Ⅰ、p-Smad2/3和GAPDH蛋白的Western blot檢測，并進行collagen-Ⅰ的免疫熒光檢測。

1.4TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的檢測

根據GenBank中TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDH的序列，設計并合成引物(表1)，利用RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒進行反轉錄制備cDNA，利用SYBR染料進行熒光定量PCR檢測。反應程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，以GAPDHmRNA的轉錄水平為內參對TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的相對轉錄水平進行計算。

表1　熒光定量PCR用到的引物和序列

1.5Western blot檢測p-Smad2/3、α-SMA和 collagen-Ⅰ 蛋白

待細胞培養(yǎng)至預定時間，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞。然后冰上用RIPA裂解細胞，細胞刮刀刮取細胞，吸取裂解液進行12 000 r·min-14 ℃離心10 min。吸取上清液，BCA法測定蛋白質濃度。加入上樣緩沖液沸水煮10 min后進行SDS-PAGE膠電泳。采用BIO-RAD垂直電泳系統(tǒng)進行常規(guī)SDS-PAGE電泳。電泳后，采用BIO-RAD的轉印儀將樣品轉移至PVDF膜，將膜置于封閉液(5%脫脂乳的PBST)室溫封閉2 h，加一抗，4 ℃冰箱過夜。洗膜后將膜孵育在含二抗的PBST溶液中，室溫下孵育1 h，用ECL試劑進行顯色，于凝膠成像系統(tǒng)中進行檢測，Western blot條帶采用Quantity one軟件進行灰度值分析計算，重復6次，取其平均值，計算標準偏差，以目的蛋白質灰度值/內參蛋白灰度值表示相對定量結果。

1.6免疫熒光方法檢測collagen-Ⅰ的蛋白質表達

細胞爬片后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液沖洗3次，0.5%Triton處理10 min，PBS沖洗3次，正常血清封閉液封閉30 min后，分別滴加一抗兔collagen-Ⅰ抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜。洗滌后滴加熒光FITC標記山羊抗兔IgG二抗(1∶100稀釋)，室溫下作用90 min，PBS沖洗3次，防淬滅劑封片、鏡檢、照相。

1.7統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05或P<0.01為具有統(tǒng)計學差異。

2結果

2.1金黃色葡萄球菌對BMFBα-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1 mRNA轉錄的影響

用104、105、106、107、108CFU·mL-1的熱滅活菌液刺激BMFB 24 h，熒光定量PCR方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1 mRNA結果顯示，不同濃度的熱滅活菌均可以使α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1的mRNA轉錄水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，其中以105CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1的mRNA轉錄水平最高(圖1)。

A.α-SMA；B. collagen-Ⅰ；C.TGF-β1；*.P<0.05；**.P<0.01圖1　熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB的α-SMA、collagen-I和TGF-β1熒光定量PCR分析Fig.1　Real-time PCR analysis of α-SMA，collagen-Ⅰ，TGF-β1 in BMFB stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA)

2.2 金黃色葡萄球菌對BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3蛋白表達的影響

用104、105、106、107、108CFU·mL-1的滅活菌液刺激BMFB 24 h，Western blot方法檢測結果顯示，不同濃度的熱滅活菌均可以使α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，其中以105CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白質表達水平最高(圖2)。

A.Western blot圖；B～D.Western blot平均灰度值；*.P<0.05；**.P<0.01A.Western blot image；B-D.The Western blot average grey value；*.P<0.05；**.P<0.01圖2　熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3免疫印跡分析Fig.2　Western blot analysis of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 in BMFB stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA)

2.3SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的表達

分別用105CFU·mL-1的滅活菌刺激BMFB 24 h，用SB-431542預處理細胞1 h后加入105CFU·mL-1滅活菌液，熒光定量PCR方法檢測α-SMA和collagen-Ⅰ的mRNA轉錄水平，結果顯示，與滅活菌刺激組比較，SB-431542預處理后加滅活菌刺激組的α-SMA和collagen-Ⅰ的mRNA轉錄水平極顯著降低(P<0.01)(圖3)。Western blot方法檢測結果顯示，與滅活菌刺激組比較，SB-431542預處理后加滅活菌刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白質表達水平極顯著降低(P<0.01)(圖4)。說明SB-431542能夠顯著抑制BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ的表達。免疫熒光方法檢測結果顯示，SB-431542預處理后加滅活菌刺激組的collagen-Ⅰ熒光染色強度較滅活菌刺激組明顯減弱(圖5)。

A.α-SMA的熒光定量PCR分析；B.collagen-Ⅰ的熒光定量PCR分析；*.P<0.05；**.P<0.01A.Real-time PCR analysis of α-SMA；B.Real-time PCR analysis of collagen-Ⅰ；*.P<0.05；**.P<0.01圖3　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的表達Fig.3　SB-431542 inhibits HKSA induced α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA in BMFB

A.Western blot圖；B～D.Western blot平均灰度值；*.P<0.05；**.P<0.01A.Western blot image；B-D.The Western blot average grey value；*.P<0.05；**.P<0.01圖4　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3蛋白表達的免疫印跡分析Fig.4　Western blot analysis of HKSA induced α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 in BMFB and inhibition by SB-431542

A.未刺激對照組；B.滅活菌刺激組；C.SB-431542預處理后滅活菌刺激組A.BMFB without stimulation；B.BMFB stimulated with HKSA；c.BMFB treated with SB-431542 and HKSA圖5　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導BMFB collagen-Ⅰ 蛋白表達的免疫熒光染色(200×)Fig.5　Immunofluorescence staining of HKSA induced collagen-Ⅰ in BMFB and inhibition by SB-431542 (200×)

3討論

金黃色葡萄球菌感染能夠誘導奶牛乳腺細胞TNF-α、IL-1、IL-6等促炎性細胞因子的免疫反應[12-13]。這些細胞因子參與了組織的損傷修復及肉芽組織的增生。在肉芽組織增生過程中，成纖維細胞被激活并表達α-SMA，成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，這些肌成纖維細胞合成細胞外基質并造成細胞外基質的沉積[14]。成纖維細胞能夠產生炎性細胞因子并對多種炎性細胞因子(如TGF-β1、IL-1、IL-6等)產生應答反應，研究發(fā)現外源TGF-β1能夠使奶牛乳腺成纖維細胞α-SMA和collagen-Ⅰ的表達水平顯著增高[15]，成纖維細胞在急慢性炎癥及炎癥消退中發(fā)揮重要作用[7]?；罹鷷е录毎趲仔r之內死亡，本研究用熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB能顯著促進TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ mRNA的升高，其原因可能是由于金黃色葡萄球菌刺激成纖維細胞分泌細胞因子誘導成纖維細胞發(fā)生表型轉化，而TGF-β1是促進成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞及細胞外基質合成的關鍵細胞因子。

TGF-β1/Smad信號通路在許多組織發(fā)生纖維化過程中起重要作用[8]，Smads作為TGF-β細胞內信號傳遞分子調控細胞膜信號轉導，Smad2/3是活化型Smad蛋白，為TGF-β1下游調節(jié)因子，肝、腎纖維化的形成與Smad2/3密切相關[16-17]。本研究用熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB能夠促進TGF-β1 mRNA、α-SMA、collagen-Ⅰ、p-Smad2/3的蛋白質表達水平顯著升高，提示金黃色葡萄球菌可能通過TGF-β1/Smad信號通路誘導奶牛乳腺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞。106、107、和108CFU·mL-1濃度的滅活菌液刺激BMFB誘導TGF-β1 mRNA的轉錄水平沒有105CFU·mL-1誘導的水平高，可能是由于高濃度菌液刺激BMFB產生的其他細胞因子(如TNF-α)抑制了TGF-β1的分泌所致[18]。

SB-431542可通過阻斷TGF-β1與Ⅰ型受體的結合，改善TGF-β1/Smad信號通路介導產生的纖維化。研究表明乙醇能促進心肌成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，并且促進TGF-β和collagen-Ⅰ的升高，SB-431542能夠減弱乙醇誘導的成纖維細胞的激活[19]。SB-431542通過抑制Smad2/3的磷酸化而抑制百草枯誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞的轉分化[20]。本研究發(fā)現SB-431542抑制熱滅活金黃色葡萄球菌誘導BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ的表達，提示SB-431542通過抑制TGF-β1/Smad信號通路從而抑制金黃色葡萄球菌誘導BMFB轉分化為肌成纖維細胞。

4結論

金黃色葡萄球菌能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導奶牛乳腺成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.025

收稿日期：2016-01-12

基金項目：黑龍江八一農墾大學博士后啟動基金

作者簡介：楊彬(1982-)，男，內蒙古呼和浩特人，講師，博士，主要從事奶牛乳腺炎致病機制的研究，E-mail: yangbin_nm@126.com *通信作者：武瑞，教授，E-mail: fuhewu@126.com

中圖分類號：S852.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1495-07

The Effect ofStaphylococcusaureuson TGF-β1/Smad Signaling Pathway and Transdifferentiation in Bovine Mammary Fibroblasts

YANG Bin，XU Dan-dan，SUN Zhi-peng，ZHAO Jia-qi，YAN Bo-wei，LI Xiao-ting，WU Rui*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

Abstract:This study aimed to investigate the effect of Staphylococcus aureus (S.aureus) on TGF-β1/Smad signaling pathway and transdifferentiation in bovine mammary fibroblasts (BMFB).BMFB were stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA) at 104，105，106，107，108 CFU·mL-1.The transcription of TGF-β1，α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA were detected by Real-time PCR after 24 h.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 protein were detected by Western blot.BMFB were pretreated with TGF-β1 receptor-specific inhibitor SB-431542，BMFB were stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA) at 105 CFU·mL-1.The transcription of α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA were detected by Real-time PCR after 24 h.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 protein were detected by Western blot.Immunofluorescence was used to detect collagen-Ⅰ expression.The results showed that the transcription level of TGF-β1 mRNA，expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 increased significantly at different concentration after 24 h stimulation compared with unstimulated BMFB (P<0.05).The expression of TGF-β1，α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 reached the maximal level at 105 CFU·mL-1.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 were significantly reduced by pretreating BMFB with SB-431542 (P<0.01).The results indicate that TGF-β1/Smad signaling pathway plays an important role in S.aureus induced BMFB transdifferentiation.

Key words:Staphylococcus aureus；bovine mammary fibroblasts；α-SMA；collagen-Ⅰ；p-Smad2/3