楊文祥，孫政國，金穗華

(1.江蘇省興化市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 興化 225700；2.南京農業(yè)大學，江蘇 南京 210014；3.農業(yè)部牛冷凍精液質量檢測中心(南京) 江蘇 南京 210095)

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家畜精(子)細胞染色方法的比較與評價

楊文祥1，孫政國2，金穗華3*

(1.江蘇省興化市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 興化 225700；2.南京農業(yè)大學，江蘇 南京 210014；3.農業(yè)部牛冷凍精液質量檢測中心(南京) 江蘇 南京 210095)

為進一步提高家畜精子形態(tài)檢驗的科學性和客觀性，本文結合種公畜精液生產和質量檢驗，對精子形態(tài)的檢驗應用姬姆薩染色法、考馬斯亮藍染色法和伊紅—苯胺黑染色法進行了比較、分析。結果表明，三種方法中姬姆薩染色法對精子細胞的染色效果最好，可視精液質量檢驗的不同要求選擇不同方法。

家畜; 精(子)細胞; 染色方法; 姬姆薩染色法; 考馬斯亮藍染色法; 伊紅—苯胺蘭染色法

家畜精液中精子所具有的生物學特性(質量性狀)均與母畜受精有密切的關系[1]，其中精子形態(tài)是評價精液質量的一項必不可缺少的技術參數(shù)；而檢驗方法作為評價的技術手段，一直受到人們的關注。近年來對于精子形態(tài)檢驗方法的研究與探討仍在繼續(xù)，本文對于不同的檢驗方法的比較、分析，為進一步提高精液質量檢驗方法的科學性與正確性，提供相關的試驗基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料

精液樣品，來自國內各個家畜精液生產企業(yè)，涉及畜種有牛、豬和羊。

1.2 方法

1.2.1 姬姆薩染色法 姬姆薩染色液配制：見GB 4143中B5.2[2]，檢驗樣品的取樣、抹片、固定、染色、鏡檢和計算(形態(tài)異常率)的操作，按照GB 4143中附錄B.5.3[2]。

1.2.2 考馬斯亮蘭染色法 高氯酸考馬斯亮藍染色液配制：取考馬斯亮藍R250(普通染料)50 mg，溶于100 mL蒸餾水，煮沸溶解，過濾后。加入高氯酸3.5 mL。

檢驗樣品取樣、抹片、固定、鏡檢和計算(形態(tài)異常率)的操作，按照GB 4143中附錄B.5.3[2]，染色時間5～10 min。

1.2.3 伊紅—苯胺蘭染色法 伊紅苯胺蘭染液配制：分別取0.5%伊紅染液和1%苯胺蘭染液按照1︰2的比例混合。

取伊紅苯胺蘭染液5～10uL滴于載玻片的一端，另取等量精液與染液混勻后，立刻抹片，抹片操作見GB 4143中附錄B.5.3[2]。

1.3 形態(tài)觀察與 圖像采集

染色樣片自然晾干，在顯微鏡400～600倍和1000倍(油鏡)下觀察精子形態(tài)的染色效果(部分伊紅—苯胺蘭染色樣片采用暗視野觀察)，應用JD801精子圖像分析軟件進行拍攝和處理。

2 結果

2.1 圖像比較

對公牛、種豬和綿羊精液用三種不同染色方法進行了取樣染色，對精子圖像觀察選擇了以形態(tài)(輪廓)、頭部(頂體)、尾部(細胞膜)作為評價部位，具體見表1。

從表1中的精子形態(tài)圖像比較看出，不同染色方法對精子的染色效果不盡一致。特別是對精子細胞膜的表現(xiàn)效果，姬姆薩染色效果最為理想。

3 討論

3.1 染色方法

3.1.1 姬姆薩染色法 主要優(yōu)點是染色后樣片在顯微鏡下觀察，精子呈深紫紅色，底色為空白，不論400～600倍還是1000倍均可達到清晰觀察精子形態(tài)變化的效果，特別是在1000倍油鏡下對于精細胞質膜的變化，精子頭部頂體結構是否異常、尾部質膜是否受損及受損程度，都可以清晰的鑒別和評價。肖婉芬等人應用對瑞氏-姬姆薩與巴氏染色法對精子形態(tài)染色效果的試驗，結果表明：姬姆薩染色法是一種簡單有效的精子形態(tài)染色方法[3]。目前，國內對于種畜精子形態(tài)的常規(guī)檢驗，在GB4143-84[2]、GB23238-2009[4]、GB20557-2006[5]等標準均明確應用姬姆薩染色法。

表1 不同染色方法的精子形態(tài)圖像比較

3.1.2 考馬斯亮蘭染色法 在蛋白質染色方法中，目前以考馬斯亮藍染色最為常用。國內有技術人員人試驗用考馬斯亮蘭染色法對家畜精子作為快速染色和精子形態(tài)鑒別方法，樣品染色后在顯微鏡下觀察，精子為淡紫色，頭部、頂體著色不明顯，尾部顏色略深，染色效果與姬姆薩染色法比較，有不同結果的報道，主要是在對精子頭部及頂體結構變化的鑒別。對人類精子形態(tài)的檢測，采用考馬斯亮蘭染色法，高久春等用改良巴氏染色法、瑞-吉(姬)染色法和考馬斯亮藍染色法精液涂片染色，檢測、計算形態(tài)正常精子率和頂體完整率，結論：瑞-吉(姬)染色法更適于頂體完整率判讀[6]。

3.1.3 伊紅—苯胺蘭染色法 在上世紀八十年代曾作為精液中活精子計數(shù)方法之一，其原理是利用活精子對特定染料不著色的特點來區(qū)分計算死、活精子的比例；顯微鏡下觀察，活精子不著色(無色)，死精子呈粉紅色，苯胺黑(蘭)為背景襯托，以此作為目測評定精子活力的校正參考。以后有人提出甘油對精子著色有干擾，使精子可滲透性增加，著色精子增多，不便用于冷凍精液的精子形態(tài)鑒別[7 ]。以后對于精子細胞的染色、觀察應用不多，近期有人提出以此作為精子形態(tài)檢驗的快速染色方法，在試驗中，400～600倍和1000倍下觀察，精子形態(tài)的輪廓可以看到，但對于精細胞膜的變化，特別是頭部、頂體部和尾部細胞膜的損傷和缺陷，與姬姆薩、考馬斯亮蘭染色法比較，難以清晰顯示。在高倍鏡下觀察時，精子未著色形態(tài)難以鑒別，特別是頂體部位不宜區(qū)分。Oral[8]等認為未著色的精液涂片僅適用于分析形態(tài)正常精子?！禬HO人類精液分析與處理實驗室手冊》第5版推薦的精子存活率試驗方法分別是伊紅Y染色法、伊紅-苯胺蘭染色法和低滲膨脹試驗，目前也多用于死、活精子的染色，少有用于精子形態(tài)的檢驗。

3.1.4 染色技術要求與質量控制 對于精子形態(tài)檢驗染色方法的選擇，應是操作過程簡單，能夠獲得最佳色效果，保證精子形態(tài)檢驗的準確性。在染色過程中，應注意對精子有最大保護，避免某些染色液(試劑)、溫度、pH值、滲透壓等物理因素對精子形態(tài)的損傷。

4 結論

任何染色方法的選擇是根據(jù)最終需要的染色效果決定的。試驗表明，以上三種染色方法均可作為檢驗精子形態(tài)的染色方法。姬姆薩染色法精子各部位著色效果好，特別是精細胞的質膜和精子的頭部(頂體及核部位)、頸、尾部線粒體容易鑒別，而且染色簡便,目前仍是實驗室追求高質量精子形態(tài)學檢驗的首選。

[1] 秦和春，金穗華.牛精液質量與受精率的關系[J].畜牧與獸醫(yī),2007.39(4)：29-30.

[2] 牛冷凍精液GB4143-84[S].北京：中華人民共和國標準化委員會.

[3] 肖婉芬,等.瑞氏-姬姆薩與巴氏染色法對精子形態(tài)染色效果比較[J].華中醫(yī)學雜志,2007.31(6)：436-438.

[4] 種豬常溫精液GB23238-2009[S].北京：中華人民共和國標準化委員會.

[5] 山羊冷凍精液GB20557-2006 [S].北京：中華人民共和國標準化委員會.

[6] 高久春，王瑞雪,等.精子形態(tài)學分析中染色方法的比較[J].吉林大學學報醫(yī)學版,2005.31(05)：778-780.

[7] 馮建超.家畜繁殖技術進展[M].重慶：科學技術文獻出版社重慶分社，1979：17-18.

[8] Oral E,Yetis O ,Elibol F,etal.Assessment of human spermmorphology by strict criteria:comparison of wet preparationversus stained with the modified Diff-Quik method[J] ArchAndrol,2002,48(4):307-314.

Comparison and Evaluation on Staining Methods of Livestock Sperm Cell

YANG Wen-xiang1,SUN Zheng-guo2,JIN Sui-hua3*

(1.XinghuaAnimalHealthSupervisionInstitute,Xinghua,Jiangsu,China225700; 2.CollegeofPratacultureScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,China210095; 3.QualitySupervisionandTestCenterofFrozenBovineSemenofMinistryofAgriculture(Nanjing),Nanjing,China210095)

In order to furtherimprove thecorrection and objectivity of morphology test of livestock sperm cell,three staining methods applied in the examination and test of livestock sperm morphology,namely Giemsa staining method,Coomassie blue staining method and eosin-nigrosine blue staining method,were analyzed and compared in this research,connecting with sire semen production.It is concluded that the staining effect by the Giemsa staining method was the best among the three methods,and the staining method could be selected in terms of the different requirements of the examination and test of semen quality using this method.

livestock;sperm cell;staining method;giemsa staining method;coomassie blue staining method;eosin-nigrosine blue staining method

7-03-06

2017-03-20

江蘇省農業(yè)三新工程項目(SXGC[2014]246)

楊文祥(1967-)，男，高級獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術推廣工作。

S814

A

1001-9111(2017)03-0024-03

*通訊作者：金穗華 (1948-)，男，江蘇南京，高級畜牧師，主要從事家畜繁殖與家畜精液質量檢驗技等方面的研究。