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        紅平菇液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

        2017-07-15 15:29:07王殿振賀曉龍趙瑞華房云云
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年9期
        關(guān)鍵詞:響應(yīng)面

        王殿振++賀曉龍++趙瑞華++房云云++任桂梅++劉月芹

        摘要:為了優(yōu)化紅平菇液體培養(yǎng)條件,更好應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,本試驗(yàn)采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量,以紅平菇菌絲體干質(zhì)量為響應(yīng)值進(jìn)行了優(yōu)化。先分別探究了不同因素對(duì)其生長(zhǎng)的影響,確定最佳水平,然后采用響應(yīng)面法擬合出最佳培養(yǎng)條件,最后結(jié)合實(shí)際驗(yàn)證得出了紅平菇液體菌種的適宜培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,紅平菇液體培養(yǎng)適宜條件,培養(yǎng)溫度為32 ℃,pH值為6.0,維生素B1含量為 16.0 mg/L。在上述條件下,紅平菇菌絲體干質(zhì)量達(dá)10.19 mg/mL,與方程預(yù)測(cè)10.34 mg/mL結(jié)果一致,比優(yōu)化前7554 mg/mL提高了34.895%,表明所得模型有一定的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。

        關(guān)鍵詞:紅平菇;菌絲干質(zhì)量;液體培養(yǎng)基;響應(yīng)面

        中圖分類號(hào): S646.1+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2017)09-0105-04

        紅平菇(Pleurotus djamor),在真菌分類學(xué)上屬于真菌門(mén)層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬,別稱紅側(cè)耳、桃紅平菇[1-3],是熱帶、亞熱帶地區(qū)木腐菌類,菌絲生長(zhǎng)快,出菇早,產(chǎn)量高,子實(shí)體色澤鮮艷,味道鮮美,是一種“能吃能觀賞”的珍稀蕈菌[4]。紅平菇子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富,屬于低脂肪、高蛋白的健康食品,纖維素含量達(dá)到25%以上[5];含多種人體必需和非必需的氨基酸、維生素和礦物質(zhì),具有抗腫瘤、抗菌、提高機(jī)體免疫力等功能;產(chǎn)量與生物學(xué)效率高[6-8]。

        目前,紅平菇雖然在國(guó)內(nèi)已被廣泛研究,1991年,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系李明等從泰國(guó)曼谷農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)了1株高溫型T-紅平菇,通過(guò)3年的研究,掌握了該菌株的生物學(xué)特性,取得了一定的研究進(jìn)展[9]。賴萬(wàn)年曾進(jìn)行過(guò)紅平菇深層發(fā)酵培養(yǎng)的研究[10],但關(guān)于紅平菇液體培養(yǎng)方面的報(bào)道還很少,而相對(duì)于傳統(tǒng)制種和栽培方式而言,液體培養(yǎng)技術(shù)具有不可比擬的優(yōu)勢(shì),更容易滿足大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的需求,是食用菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必然趨勢(shì)。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)紅平菇在不同維生素B1濃度、不同pH值、不同溫度時(shí)應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化,為紅平菇液體培養(yǎng)提供一定的參考依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1供試菌種

        紅平菇菌種由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.1.2培養(yǎng)基

        固體培養(yǎng)基:稱取去表皮洋蔥200 g,切片,沸水煮30 min,8層紗布過(guò)濾,取濾液,加入已稱量好的藥品(葡萄糖20 g、酵母膏5 g、磷酸二氫鉀1.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂15 g),加熱攪拌溶解,定容,分裝試管(8 mL/管),121 ℃滅菌30 min,無(wú)菌檢驗(yàn),備用。

        液體培養(yǎng)基:方法同上,去掉瓊脂,配成后裝入三角瓶(規(guī)格為150 mL)中,50 mL/瓶,121 ℃滅菌30 min,無(wú)菌檢驗(yàn),備用。

        1.1.3試劑

        DNS試劑:取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和 262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液加到含192 g酒石酸鉀鈉的熱溶液中,再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉,攪拌溶解,冷卻后加蒸餾水定溶至1 000 mL,于棕色瓶中待用[11]。

        1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:葡萄糖干燥至恒重,準(zhǔn)確稱取1.00 g葡萄糖,用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL。

        1.2方法

        1.2.1菌株活化

        將母種接種于斜面培養(yǎng)基中,于25 ℃培養(yǎng)8 d,制得活化菌株。

        1.2.2菌種培養(yǎng)

        將活化后的菌種制成菌懸液,并且接種于液體培養(yǎng)基中,每瓶接種1 mL,于25 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。

        1.2.3生長(zhǎng)曲線的繪制

        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試驗(yàn)見(jiàn)表1。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

        還原糖含量測(cè)定:按表2添加試劑,搖勻,沸水浴5 min,取出迅速放入冷水中,降到室溫時(shí),加蒸餾水定容至25 mL,搖勻,測(cè)定吸光度D550 nm。

        菌絲干質(zhì)量的測(cè)定:濾紙烘干至恒質(zhì)量,質(zhì)量記為m1;每天取3個(gè)三角瓶,真空泵抽濾,得到菌絲體與菌液,菌液放在冰上用于還原糖的測(cè)定,菌絲與濾紙烘干至恒質(zhì)量稱量,質(zhì)量記為m2。m2-m1即為菌絲干質(zhì)量。

        根據(jù)還原糖含量的變化和菌絲干質(zhì)量的變化繪制菌絲生長(zhǎng)曲線。

        1.2.4單因素試驗(yàn)

        溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:將菌懸液接種于液體培養(yǎng)基中,分別置于20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量,每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

        pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響:接種方法同上,pH值設(shè)5個(gè)梯度:pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

        維生素B1濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響:接種方法同上,維生素B1濃度設(shè)5個(gè)梯度,分別為0、5、10、15、20 mg/L,培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定還原糖和菌絲干質(zhì)量,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

        1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,優(yōu)化最佳條件的范圍,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12],運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn),分別以影響最大的因素為自變量,菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值。Box-Behnken試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3。

        2結(jié)果與分析

        2.1紅平菇基礎(chǔ)試驗(yàn)

        2.1.1紅平菇生長(zhǎng)曲線

        從圖2可以看出,紅平菇在培養(yǎng)后2 d開(kāi)始生長(zhǎng),8 d左右生長(zhǎng)速率達(dá)到最大,10 d菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大,菌絲干質(zhì)量整體曲線呈增長(zhǎng)趨勢(shì),繼續(xù)培養(yǎng)菌絲體干質(zhì)量基本保持不變,符合其生長(zhǎng)規(guī)律。故確定紅平菇液體培養(yǎng)最佳時(shí)間為8 d。

        2.1.2紅平菇還原糖含量測(cè)定

        從圖3可以看出,在前2 d還原糖含量呈下降趨勢(shì),這可能是培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后,某些淀粉類物質(zhì)降解的還原糖為紅平菇菌絲體的初期生長(zhǎng)提供速效碳源,在2~12 d,還原糖含量整體呈上升趨勢(shì),但在4 d時(shí)含量急劇下降,變化比較明顯,可能是碳源物質(zhì)的消耗和菌絲體數(shù)量的增長(zhǎng),使得培養(yǎng)后期還原糖含量下降。

        2.2單因素試驗(yàn)

        2.2.1不同溫度對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

        從圖4、圖5可以看出,在溫度為20~35 ℃時(shí),隨著溫度提高菌絲干質(zhì)量呈上升趨勢(shì),還原糖含量呈下降趨勢(shì),可能是菌絲體生長(zhǎng)旺盛,還原糖消耗較快;當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)菌絲干質(zhì)量下降,生長(zhǎng)速度明顯減慢,還原糖含量也開(kāi)始上升,可能是菌絲體活力下降,還原糖消耗減慢。表明紅平菇在溫度為35 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好。

        2.2.2不同pH值對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

        從圖6、圖7可以看出,pH值在4~6時(shí),隨pH值增加菌絲干質(zhì)量呈上升趨勢(shì),還原糖含量呈下降趨勢(shì);pH值為6時(shí),菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大,還原糖含量也較低。pH值在6~8時(shí),菌絲干質(zhì)量和還原糖含量都降低。表明紅平菇最適pH值為6。

        2.2.3不同濃度維生素B1對(duì)紅平菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

        從圖8、圖9可以看出,維生素B1濃度為0~15 mg/L時(shí),菌絲干質(zhì)量隨著維生素B1濃度的增加呈上升趨勢(shì),還原糖含量呈下降趨勢(shì);濃度為15~20 mg/L時(shí)紅平菇菌絲干質(zhì)量下降,還原糖含量有所增加。試驗(yàn)結(jié)果表明,紅平菇最適維生素B1濃度為15 mg/L。

        2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

        2.3.1Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

        在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以溫度、pH值、維生素B1含量為自變量,以紅平菇菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。 2.3.2回歸方差分析

        由表4數(shù)據(jù)擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程(1)菌絲干質(zhì)量=-7.877 05-0.145 55A+3.020 82B+0.358 61C-3.389 50×10-3AB-3.527 75×10-3AC+0.011 944BC+2.152 73×10-3A2-0.255 17B2-9847 17×10-3C2。

        從表5可以看出,對(duì)紅平菇菌絲干質(zhì)量所建立的二次多項(xiàng)模型具有顯著性;失擬項(xiàng)不顯著(P=0.654 3>0.05),表明回歸方程擬合充分,可以用此模型對(duì)紅平菇菌絲生長(zhǎng)進(jìn)行分析。顯著性檢驗(yàn)表明,溫度對(duì)菌絲干質(zhì)量極顯著,維生素B1含量對(duì)菌絲干質(zhì)量影響顯著,pH值對(duì)菌絲干質(zhì)量影響顯著,各因子對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響程度為:A(溫度)>C(維生素B1)>B(pH值)。各交互項(xiàng)按影響大小排序依次為AC、BC、AB,表明不同因素對(duì)菌絲干質(zhì)量的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系。

        2.3.3響應(yīng)面分析

        根據(jù)回歸曲線作出的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖可直觀地考察出不同因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響,等高線圖的形狀反映出因素交互影響的強(qiáng)弱,橢圓形或馬鞍形的等高線圖表示交互影響顯著,而圓形圖則表示不顯著,結(jié)果見(jiàn)圖10、圖11、圖12,溫度與維生素B1的交互影響極顯著,溫度與pH值的交互影響顯著,pH值與維生素B1的交互影響不顯著。

        2.3.4回歸模型預(yù)測(cè)優(yōu)化值

        根據(jù)回歸方程(1)分別求3個(gè)自變量的一階偏導(dǎo)并查出對(duì)應(yīng)真實(shí)值分別為A=32 ℃、B=609、C=16.23 mg/L,菌絲干質(zhì)量預(yù)測(cè)值為 10.28 mg/mL。

        2.3.5優(yōu)化工藝條件的驗(yàn)證

        考慮實(shí)際的可操作性,對(duì)優(yōu)化工藝參數(shù)修正溫度為32 ℃、pH值為6.00、維生素B1含量為16.00 mg/L,對(duì)回歸優(yōu)化模型的條件進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,菌絲干質(zhì)量為10.19 mg/mL,與方程預(yù)測(cè)一致,表明所得模型有一定的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義。

        3討論

        本試驗(yàn)采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得紅平菇液體培養(yǎng)最優(yōu)條件:培養(yǎng)溫度為32 ℃,pH值為6.0,維生素B1含量為 16.0 mg/L。在最優(yōu)條件下,紅平菇菌絲干質(zhì)量可達(dá)到了 10.19 mg/mL,比優(yōu)化前7.554 mg/mL提高了34.895%。試驗(yàn)結(jié)果表明,在紅平菇液體菌種培養(yǎng)的過(guò)程中,響應(yīng)面法能有效地優(yōu)化培養(yǎng)條件。

        國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者通過(guò)響應(yīng)面分析法在培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了良好效果。本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析,以菌絲干質(zhì)量為響應(yīng)值,采用回歸擬合方程,并通過(guò)方差分析獲得了最佳培養(yǎng)條件,為今后紅平菇液體培養(yǎng)提供了技術(shù)依據(jù)。

        參考文獻(xiàn):

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