吳嘉韻++吳森++戴超輝++吳圣龍++包文斌

摘要：為了揭示DLG5基因在機(jī)體抵抗大腸桿菌刺激過(guò)程中發(fā)揮的功能，本試驗(yàn)利用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染豬腸上皮細(xì)胞系（IPEC-J2）模擬個(gè)體的致病過(guò)程，用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)DLG5基因在感染前后的表達(dá)變化情況，在細(xì)胞水平上探討DLG5基因表達(dá)水平與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌抗性的關(guān)系。結(jié)果表明，3種大腸桿菌的菌清和菌體刺激IPEC-J2后，DLG5基因表達(dá)水平均發(fā)生顯著或極顯著上調(diào)；并且由F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達(dá)水平上調(diào)的程度要極顯著高于F18ac菌體刺激后的表達(dá)水平。[JP3]本研究結(jié)果提示，豬DLG5基因表達(dá)和大腸桿菌的抗性具有密切關(guān)系，可能與其在一定程度上能夠促進(jìn)腸道屏障的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能發(fā)揮有關(guān)。

關(guān)鍵詞：豬；DLG5基因；產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌；抗病育種；表達(dá)水平；腸上皮細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)： S828文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0127-03

仔豬斷奶前后腹瀉是規(guī)模化豬場(chǎng)最常見(jiàn)的疾病。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，簡(jiǎn)稱ETEC）是引起斷奶前后腹瀉的主要病原菌。仔豬斷奶后，小腸的形態(tài)和功能都發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。此外，斷奶期間消化酶的活性降低，影響腸黏膜的修復(fù)和結(jié)構(gòu)的完整性[2]，導(dǎo)致大量致病性大腸桿菌的入侵從而引起疾病，因此仔豬腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整性是抵抗產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌等外來(lái)病原菌侵襲的基本保障[3]，同時(shí)是維持腸道屏障相關(guān)基因（蛋白）表達(dá)對(duì)腹瀉的抗性具有的重要調(diào)控作用[4]。

DLG5（discs large homologs 5）基因位于10號(hào)染色體q23，全長(zhǎng)約79 kb，含32個(gè)具有編碼功能的外顯子，其編碼的蛋白是膜結(jié)合相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MAGUK）家族成員之一，主要參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)并起到構(gòu)建細(xì)胞骨架的作用[5]。有相關(guān)研究證明，DLG5基因還具有穩(wěn)定頂端蛋白復(fù)合體的功能，與上皮細(xì)胞的完整性和極性的保持有關(guān)[6]。課題組前期篩選出miR-192和 miR-215可能是調(diào)控?cái)嗄套胸i抗F18大腸桿菌感染的重要miRNAs，而DLG5基因就是兩者共同靶向調(diào)控的關(guān)鍵靶基因，結(jié)合DLG5基因的生物學(xué)功能，初步表明豬DLG5基因可能與斷奶仔豬腸道上皮的完整性以及大腸桿菌的抗性密切相關(guān)[7-8]。為進(jìn)一步揭示DLG5基因在機(jī)體抵抗大腸桿菌刺激過(guò)程中發(fā)揮的功能，本試驗(yàn)在細(xì)胞水平上利用產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）侵染豬腸上皮細(xì)胞系（IPEC-J2），用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)DLG5基因在侵染前后的表達(dá)變化情況，分析DLG5基因的表達(dá)水平與大腸桿菌侵染的關(guān)系，為下一步探討DLG5基因的功能提供更加直接的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

豬腸上皮細(xì)胞系（IPEC-J2）和大腸桿菌（F18ab、F18ac和K88ac）由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院畜禽病原微生物研究室惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）；PBS磷酸緩沖液（干粉）購(gòu)自北京賽因坦科技有限公司（中國(guó)，北京）；Trizol裂解液購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2IPEC-J2細(xì)胞的培養(yǎng)

將IPEC-J2細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種到3板12孔板中，用含10% FBS的完全培養(yǎng)液（DMEM與F12培養(yǎng)基 1 ∶1 混合）在恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)至密度達(dá)到約90%。

1.3大腸桿菌菌液侵染IPEC-J2細(xì)胞

將大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac分別接種至LB培養(yǎng)液，在恒溫?fù)u床（37 ℃，200 r/min）中搖菌12 h，離心（4 000 r/min，10 min），分別收集菌清和菌體。向“1.2”步驟中2板12孔板的每個(gè)培養(yǎng)孔（處理孔和培養(yǎng)孔各設(shè)3個(gè)重復(fù)）各加200 μL上清液和800 μL培養(yǎng)液，放于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）分別孵育4、8 h后收集細(xì)胞用于提取總RNA。

1.4大腸桿菌菌體侵染IPEC-J2細(xì)胞

將上一步驟中收集的菌體用PBS緩沖液洗滌并離心（重復(fù)3次）。用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)菌稀釋至1.0×109 CFU/mL，每個(gè)培養(yǎng)孔（處理孔和培養(yǎng)孔各設(shè)3個(gè)重復(fù)）加入1.0 mL細(xì)菌懸液，于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）孵育4 h后收集細(xì)胞用于提取總RNA。

1.5引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DLG5基因序列（登錄號(hào)：XM_005671132.1），利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，為避免基因組DNA污染，引物跨外顯子設(shè)計(jì)；以GAPDH基因作為內(nèi)參，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.6細(xì)胞總RNA提取和cDNA合成

利用Trizol法提取各孔板細(xì)胞總RNA，提取步驟嚴(yán)格按照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)操作，并以1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整程度，使用ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度及純度，產(chǎn)物-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成反應(yīng)體系（10 μL）為：5×qRT SuperMix Ⅱ 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條[JP3]件為：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7實(shí)時(shí)熒光定量

實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為：模板cDNA 2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×SYBR Premix ExTapTM Ⅱ 10 μL，50×ROXReference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase free ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線的分析，具體程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

相對(duì)定量的結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析處理，并利用SPSS 17.0軟件一般線性模型（general linear model，GLM）的Univariate統(tǒng)計(jì)方法分析不同菌體刺激的差異顯著性，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的純度與完整性檢測(cè)

提取的細(xì)胞總RNA經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)清晰的28S、18S、5S共3條帶，無(wú)DNA污染條帶及明顯降解，NanoDrop ND-1000核酸/蛋白濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度，樣本的D260 nm/D280 nm為1.8～1.9，說(shuō)明RNA提取的完整性和純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線與熔解曲線

根據(jù)熒光值的變化，系統(tǒng)自動(dòng)生成反應(yīng)循環(huán)數(shù)與檢測(cè)熒光量變化的擴(kuò)增反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，而擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性由熔解曲線可以判斷。由圖1可知，DLG5基因成功實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，且qPCR產(chǎn)物只有1個(gè)特異峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物生成。

2.3大腸桿菌菌清刺激IPEC-J2細(xì)胞4 h和8 h后DLG5基因的表達(dá)水平

分別以未經(jīng)大腸桿菌刺激處理的對(duì)照組表達(dá)水平為1，將3種大腸桿菌菌清侵染4 h和8 h后細(xì)胞中DLG5基因 mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行均一化處理。由圖2可知，F(xiàn)18ab和K88ac菌清刺激豬腸上皮細(xì)胞4 h后，DLG5基因表達(dá)水平均發(fā)生顯著上調(diào)（P<0.05），F(xiàn)18ac菌清刺激4 h后，DLG5基因表達(dá)水平發(fā)生極顯著上調(diào)（P<0.01），但是3種菌清刺激4 h后DLG5基因相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。3種大腸桿菌菌清刺激豬腸上皮細(xì)胞8 h后，DLG5基因表達(dá)水平均發(fā)生極顯著上調(diào)（P<0.01），且3種大腸桿菌菌清處理8 h后細(xì)胞中DLG5基因相對(duì)表達(dá)水平都沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。結(jié)果還顯示，3種大腸桿菌菌清刺激處理8 h后DLG5基因表達(dá)[CM（25]水平上調(diào)的程度均極顯著高于處理4[KG*3]h后的上調(diào)程度 （P<0.01）。

2.4DLG5基因在大腸桿菌菌體刺激IPEC-J2后的表達(dá)水平

以未經(jīng)大腸桿菌刺激處理的對(duì)照組表達(dá)水平為1，對(duì)3種大腸桿菌刺激處理的細(xì)胞中DLG5基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行均一化處理。由圖3可知，3種大腸桿菌刺激IPEC-J2后，DLG5基因表達(dá)水平均發(fā)生極顯著上調(diào)（P<0.01），差異倍數(shù)分別為4、2、4倍；并且F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達(dá)水平上調(diào)的程度要極顯著高于F18ac菌體刺激后的表達(dá)水平（P<0.01），但是F18ab和K88ac這2種菌體刺激后DLG5基因表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3討論

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）是引起斷奶前后仔豬腹瀉和水腫的主要病原菌，菌體表面特異菌毛按黏附素（菌毛）性質(zhì)可將E.coli分為F18、K88、K99、F41、987P等，ETEC通過(guò)表面菌毛黏附于仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞上的刷狀緣受體，定居并大量繁殖，同時(shí)產(chǎn)生腸毒素，刺激小腸黏膜細(xì)胞，破壞腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最后引起仔豬腹瀉、脫水甚至死亡[9，11]。大量研究報(bào)道認(rèn)為DLG5基因是人炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的候選易感基因，而IBD的特征之一為腸上皮屏障功能受損[5，12]。DLG5蛋白廣泛分布于機(jī)體心臟、肝臟、腸道上皮等組織[13]，能與其他蛋白互作形成蛋白復(fù)合物，再與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白連結(jié)，在維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)傳遞和維持細(xì)胞骨架等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。因此，當(dāng)機(jī)體腸道受到外源感染時(shí)，DLG5的較高水平表達(dá)可能會(huì)在一定程度上緩解腸道組織細(xì)胞的增殖和凋亡，降低病原的侵染速率。結(jié)合本次試驗(yàn)結(jié)果，3種大腸桿菌的菌清或菌體刺激IPEC-J2后，細(xì)胞中DLG5基因的相對(duì)表達(dá)均顯著上調(diào)，且用菌清刺激IPEC-J2細(xì)胞的時(shí)間越久，DLG5基因的相對(duì)表達(dá)水平越高，進(jìn)一步證實(shí)了DLG5在一定程度上能夠促進(jìn)腸道屏障的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能發(fā)揮，并且在大腸桿菌侵襲仔豬腸道中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本次試驗(yàn)結(jié)果還顯示，F(xiàn)18ab和K88ac這2種菌體刺激引起DLG5基因表達(dá)上調(diào)的程度均極顯著高于F18ac（P<0.01），這從一定程度上說(shuō)明了不同種類(lèi)的大腸桿菌對(duì)機(jī)體的侵襲能力可能存在差異，F(xiàn)18ab和K88ac這2種大腸桿菌對(duì)小腸上皮細(xì)胞的侵襲能力要強(qiáng)于F18ac。此外，大腸桿菌菌體刺激4 h后和菌清刺激8 h后的引起的DLG5基因表達(dá)都極顯著上調(diào)（P<0.01），菌體引起的差異倍數(shù)分別為4、2、4倍，而菌清引起的差異倍數(shù)均為2倍，由此可見(jiàn)大腸桿菌菌體對(duì)小腸上皮細(xì)胞的侵襲能力要強(qiáng)于大腸桿菌菌清。

體外模擬個(gè)體的致病過(guò)程，特別是以宿主細(xì)胞為素材進(jìn)行相關(guān)研究是驗(yàn)證基因功能的重要手段。為了在細(xì)胞水平揭示DLG5基因在機(jī)體抵抗大腸桿菌刺激過(guò)程中發(fā)揮的功能，本研究利用3種大腸桿菌的菌清和菌體刺激IPEC-J2細(xì)胞，通過(guò)分析刺激前后細(xì)胞中DLG5基因的表達(dá)變化，初步證實(shí)了DLG5基因在大腸桿菌刺激過(guò)程中確實(shí)發(fā)揮了一定的調(diào)控作用；但考慮到離體培養(yǎng)的豬腸上皮細(xì)胞系并不能完全模擬體內(nèi)腸道組織的生長(zhǎng)環(huán)境，所以本研究只能初步說(shuō)明DLG5基因的表達(dá)和大腸桿菌的抗性具有密切關(guān)系，DLG5基因在大腸桿菌刺激過(guò)程中的調(diào)控作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。下一步還將利用基因敲除和干擾技術(shù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型制備等手段，在動(dòng)物模型上進(jìn)行大腸桿菌體外攻毒試驗(yàn)，并在群體水平中進(jìn)行系統(tǒng)分析驗(yàn)證，以期為豬抗大腸桿菌病分子選育工作提供指導(dǎo)和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cabrera R A，Usry J L，Arrellano C，et al. Effects of creep feeding and supplemental glutamine or glutamine plus glutamate （Aminogut） on pre- and post-weaning growth performance and intestinal health of piglets[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology，2013，4（1）：29.

[2]Godlewski M M，Bierla J B，Strzalkowski A，et al. A novel cytometric approach to study intestinal mucosa rebuilding in weaned pigs fed with dietary nucleotides[J]. Livestock Science，2009，123（2）：215-220.

[3]謝天宇，胡紅蓮，高民. 腸黏膜免疫屏障及其保護(hù)措施[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（5）：1157-1163.

[4]張影超，王希彪，崔世泉，等. 腸上皮緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)與仔豬斷奶腹瀉關(guān)系的研究[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（9）：221-224.

[5]馮贇，鄭萍. DLG5與克羅恩病相關(guān)性的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際消化病雜志，2008，28（4）：277-279.

[6]Friedrichs F，Stoll M. Role of discs large homolog 5[J]. World Journal of Gastroenterology，2006，12（23）：3651-3656.

[7]Ye L，Su X M，Wu Z C，et al. Analysis of differential miRNA expression in the duodenum of Escherichia coli F18-sensitive and -resistant weaned piglets[J]. PLoS One，2012，7（8）：e43741.

[8]吳正常，殷學(xué)梅，孫麗，等. 豬miR-192/-215的組織表達(dá)譜及其關(guān)鍵靶基因分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（11）：2251-2261.

[9]葉蘭，潘章源，黃雪根，等. 蘇太豬抗F18+大腸桿菌病基礎(chǔ)群FUT1基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：158-161.

[10]張培晏，劉峻. 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌菌毛的研究進(jìn)展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2016，43（1）：32-34.

[11]陳傳榮，韓敏敏，張乃嘉，等. 腹瀉仔豬源致病性大腸桿菌生物膜與耐藥性及毒力的相關(guān)性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（10）：2234-2241.

[12]黃盛秋，徐輝. 克羅恩病易感基因研究進(jìn)展[J]. 西南軍醫(yī)，2013，15（2）：188-191.

[13]Shah G，Brugada R，Gonzalez O，et al. The cloning，genomic organization and tissue expression profile of the human DLG5 gene[J]. BMC Genomics，2002，3（1）：6.

[14]Stoll M，Corneliussen B，Costello C M，et al. Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease[J]. Nature Genetics，2004，36（5）：476-480.