程勇++任道全++陳根元++矯繼峰++王帥

摘要：為研究苦馬豆素對家兔睪丸生精細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步探討瘋草的中毒機(jī)理，將24只雄性家兔隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，試驗(yàn)組分別按照Ⅰ組15%（苦馬豆素含量30 mg/kg）、Ⅱ組30%（苦馬豆素含量60 mg/kg）、Ⅲ組45%（苦馬豆素含量90 mg/kg）的比例添加瘋草小花棘豆，對照組僅飼喂苜蓿干草，試驗(yàn)期70 d。分別于攻毒后第14、第35、第70天每次每組隨機(jī)采集2只家兔的睪丸，通過流式細(xì)胞儀測定生精細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，從第35天開始，試驗(yàn)組家兔生精細(xì)胞凋亡率均極顯著升高（P<0.01），其中單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞凋亡率均極顯著升高（P<0.01），但四倍體細(xì)胞數(shù)量無顯著變化。與對照組相比，中毒家兔睪丸生精細(xì)胞數(shù)量在G0/G1期升高，在S期降低，而且G1期與S期細(xì)胞數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)。說明苦馬豆素可導(dǎo)致家兔睪丸組織生精細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出一定的時間-劑量效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：苦馬豆素；家兔；生精細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；時間-劑量效應(yīng)

中圖分類號： S816.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0138-03

瘋草是豆科黃芪屬和棘豆屬有毒植物的總稱，是西北地區(qū)草原畜牧業(yè)危害最嚴(yán)重的有毒植物[1]，具有根系發(fā)達(dá)、返青早、抗逆性強(qiáng)、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，極易成為草原中的優(yōu)勢種[2]。新疆維吾爾自治區(qū)每年因采食瘋草中毒的放牧家畜約100萬只（頭），其中超過50%的中毒家畜死亡[3]?？囫R豆素（swainsonine，SW）是一種多羥基吲哚里西啶生物堿，國內(nèi)外研究表明其是瘋草的主要毒性成分[4]，中毒家畜主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其中睪丸、卵巢、腦組織等器官均出現(xiàn)細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞核萎縮等病理變化[5]。王帥等研究發(fā)現(xiàn)，SW可導(dǎo)致中毒家兔睪丸萎縮、精子數(shù)量與活性降低，最終導(dǎo)致雄性動物生精功能障礙[6]。張樑檢測了SW對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)SW 可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞核濃縮，DNA 片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。目前有關(guān)SW對細(xì)胞凋亡影響的試驗(yàn)主要集中于其對癌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的作用上，對生精細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制未見報道。本試驗(yàn)通過制備亞慢性瘋草中毒家兔模型，探討苦馬豆素對家兔生精細(xì)胞周期的影響，為家畜瘋草中毒的防治提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1.1材料

瘋草樣品為采自新疆維吾爾自治區(qū)策勒縣恰哈鄉(xiāng)的小花棘豆（Oxytropis glabra DC）風(fēng)干樣，由塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)教研室鑒定。

1.1.2試劑

Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司；DNA-Perp Stain 細(xì)胞周期試劑盒，美國Beckman Coulter公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器

FAC Scam 型流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；5810 R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorff公司。

1.2試驗(yàn)動物分組與處理

雄性家兔24只，體質(zhì)量（2.0±0.1） kg/只，平均分為對照組和3個試驗(yàn)組，分籠飼養(yǎng)。對照組僅飼喂青苜蓿干草，試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別飼喂摻入小花棘豆15%、30%、45%（按氣相色譜法計算苦馬豆素含量分別為30、60、90 mg/kg[8]）的混合干草，試驗(yàn)期70 d。試驗(yàn)第14、第35、第70天各組分別剖殺2只家兔取睪丸，將家兔睪丸組織剪成1～2 mm大小，置于5 mL PBS液（pH值7.4）中，渦旋振蕩3 min后使用400目尼龍濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min后棄去上清，再置于 5 mL PBS液中混勻。相同條件下重復(fù)3次即得到單細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞周期比例和細(xì)胞凋亡率的檢測。

1.3苦馬豆素對家兔生精細(xì)胞周期的影響

使用PBS沖洗單細(xì)胞懸液1～2 次，加入質(zhì)量濃度為0125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS 漂洗3次后收集細(xì)胞于離心管中；4 ℃、2 000 r/min 離心10 min后棄去上清，加入1 mL 75%乙醇 4 ℃ 固定過夜；然后4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，PBS 漂洗3次后再于4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min，將細(xì)胞重懸于200 μL PBS液中，加入 5 μL RnaseA，37 ℃反應(yīng)1 h，再加入 10 μL Triton-X-100 和 5 μL PI，4 ℃下避光孵育 30 min，1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4苦馬豆素致家兔生精細(xì)胞凋亡率的測定

使用PBS沖洗單細(xì)胞懸液1～2 次，加入質(zhì)量濃度為0125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS 漂洗3次后收集細(xì)胞于離心管中；4 ℃、2 000 r/min 離心10 min后棄去上清，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，使用250目尼龍濾網(wǎng)過濾；然后4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer中，加入 10 μL AnnexinV-FITC和 5 μL PI，4 ℃下避光孵育 30 min，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測。

1.5數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0中One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析及Duncans多重比較，檢驗(yàn)誤差為5%和1%。

2結(jié)果與分析

2.1苦馬豆素對家兔性行為的影響

試驗(yàn)初期攻毒家兔與對照家兔行為均表現(xiàn)正常，攻毒第14 天時攻毒家兔出現(xiàn)精神沉郁、被毛豎立、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象；與雌兔接觸時，對照家兔的性反應(yīng)時間短于攻毒家兔，爬跨次數(shù)也多于攻毒家兔。隨著攻毒時間的延長，攻毒家兔均出現(xiàn)喜臥、嗜睡等典型中毒癥狀[5]，與雌兔接觸時基本無正常的性行為表現(xiàn)。說明苦馬豆素可顯著影響雄性家兔的性行為。

2.2苦馬豆素對家兔睪丸生精細(xì)胞周期的影響

由圖1可知，苦馬豆素攻毒家兔睪丸生精細(xì)胞與對照家兔相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，S期細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，而且G1期與S期細(xì)胞數(shù)量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中高劑量攻毒組家兔的變化最為明顯。

2.3苦馬豆素對家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡率的影響

家兔睪丸生精細(xì)胞主要分為單倍體細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞。由圖2可知，與對照組相比，第14 天時試驗(yàn)組家兔單倍體細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照家兔（P<005），但僅試驗(yàn)Ⅲ組家兔生精細(xì)胞凋亡率顯著高于對照（P<0.05）。第35天時試驗(yàn)組單倍體細(xì)胞凋亡率和生精細(xì)胞凋亡率均極顯著高于對照（P<0.01），但二倍體細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照家兔（P<0.05）。第70 天時試驗(yàn)組單倍體細(xì)胞凋亡率、二倍體細(xì)胞凋亡率和生精細(xì)胞凋亡率均極顯著高于對照家兔（P<0.01），但整個試驗(yàn)期內(nèi)四倍體細(xì)胞凋亡率與對照差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

睪丸細(xì)胞主要包括單倍體細(xì)胞（精子細(xì)胞和精子）、二倍體細(xì)胞（G0期精原細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞）以及四倍體細(xì)胞（粗線期、細(xì)線期、雙線期的初級精母細(xì)胞和 G2期的精原細(xì)胞等），另外還有一些較為分散的細(xì)胞由進(jìn)[CM（25]行DNA合成的精原細(xì)胞和細(xì)線前期精母細(xì)胞組成。正常情況下，睪丸的精原細(xì)胞在促性腺激素和雄性激素作用下，依次經(jīng)過精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)變成為高度分化的精子。其中減數(shù)分裂前的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞有較高的自發(fā)凋亡現(xiàn)象，但精子細(xì)胞很少發(fā)生凋亡，這是保證隨后的精子正常生長所必需的。其意義在于維持成熟精子的質(zhì)量和數(shù)量，清除染色體異常的生精細(xì)胞，保持生精細(xì)胞與支持細(xì)胞數(shù)量上的平衡。其中，四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞的比率反映了精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為初級精母細(xì)胞的效率，單倍體細(xì)胞與四倍體細(xì)胞的比率顯示了減數(shù)分裂的效果，單倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞的比率反映了精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子細(xì)胞的效率。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒主要影響動物的繁殖和神經(jīng)系統(tǒng)，其中雄性中毒動物表現(xiàn)為性欲低下，無配種能力。Jyothi等研究表明，睪丸生精細(xì)胞凋亡時精原細(xì)胞的凋亡比較嚴(yán)重，即多數(shù)生殖毒性物質(zhì)的靶細(xì)胞是精原細(xì)胞[9]。本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測了家兔睪丸內(nèi)各種生精細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，苦馬豆素攻毒家兔睪丸單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞凋亡率均極顯著升高，但四倍體細(xì)胞凋亡率無明顯變化，說明苦馬豆素可顯著影響家兔減數(shù)分裂及精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為初級精母細(xì)胞的效率，即苦馬豆素主要影響精原細(xì)胞和次級精母細(xì)胞。

通過流式細(xì)胞儀檢測苦馬豆素攻毒對家兔睪丸生精細(xì)胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，與對照相比，中毒家兔睪丸生精細(xì)胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量降低。表明苦馬豆素可能抑制了S期DNA的合成與修復(fù)過程，從而使S期細(xì)胞數(shù)量降低，并抑制了S期細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，另外還對細(xì)胞進(jìn)入G1期有一定的促進(jìn)作用。凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)，處于分裂增殖階段的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞對苦馬豆素較為敏感。其原因可能為精原細(xì)胞和精母細(xì)胞分別處于有絲分裂和減數(shù)分裂期，在S期須打開DNA雙鏈以合成新的DNA，而裸露的DNA對苦馬豆素的作用較為敏感，容易產(chǎn)生DNA損傷[10]。當(dāng)DNA損傷超過自身的修復(fù)能力時，將導(dǎo)致同源染色體配對、交換和分離的紊亂，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果與郭全海等的研究結(jié)論[11]一致，初步闡明了苦馬豆素對家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制。

本研究從細(xì)胞生物學(xué)水平探討了苦馬豆素對家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，為瘋草中毒的防治提供了一定的參考。與對照組相比，中毒家兔睪丸精原細(xì)胞和次級精母細(xì)胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量降低，表明苦馬豆素可能抑制了精原細(xì)胞和次級精母細(xì)胞S期DNA的合成與修復(fù)過程。

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