郭建華

摘要 [目的]研究不同蔗糖濃度的高滲液對滲透休克法（Osmotic Shock）提取細胞周質蛋白的影響。[方法]將已經構建好的含F(xiàn)bpA基因的表達質粒轉化到EC感受態(tài)細胞中，分別在20%、30%、40%和50%的蔗糖高滲液條件下用Osmotic Shock純化蛋白，SDS-PAGE電泳檢測蛋白。[結果] 30%和40%的蔗糖高滲液能得到濃度更高的重組蛋白，而用20%和50%的蔗糖高滲液提取蛋白產量較低。[結論]30%和40%的蔗糖高滲液能提高Osmotic Shock法提取細胞周質重組蛋白產量。

關鍵詞 蔗糖；滲透休克；細胞周質；重組蛋白

中圖分類號 S188+.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0147-02

Effect of Sucrose Concentration on Periplasm Recombination Protein Extracted by Osmotic Shock

GUO Jian-hua（Department of Veterinary Medicine， Rongchang Campus， Southwest University， Chongqing 402460）

Abstract [Objective]To study the effect of hypertonic solutions with different sucrose concentrations on periplasm protein extracted by Osmotic Shock method. [Method]The constructed vector with FbpA gene was transformed to EC competent cell. The recombination proteins were extracted by Osmotic Shock method with 20%， 30%， 40% and 50% sucrose respectively.The protein was detected by SDS-PAGE electrophoresis.[Result]The result showed that using 30%and 40% sucrose hypertonic solutions could receive more recombination proteins， while 20% and 50% sucrose solutions received fewer protein.[Conclusion]30%and 40% sucrose hypertonic solutions could increase the production of periplasm recombination protein extracted by Osmotic Shock.

Key words Sucrose；Osmotic Shock；Periplasm；Recombination protein

由于大腸桿菌遺傳背景清楚，操作簡單，便于進行大規(guī)模培養(yǎng)等，因此常用于表達基因工程的重組蛋白，其在醫(yī)藥、農業(yè)等行業(yè)的應用非常廣泛，但目標重組蛋白的提取、純化往往耗時費力，產量低且成本高昂，有時需要用到專業(yè)、昂貴的儀器和設備，如細胞破碎儀、親和層析柱等，或者需要用到昂貴的試劑，如Nickel等，其操作繁瑣，蛋白產量也受影響[1]。

細胞周質（Periplasm）是位于革蘭氏陰性細菌內膜和外膜之間的結構，其氧化環(huán)境有利于蛋白的折疊，所以其蛋白純化也比較簡單。研究表明，用滲透休克法（Osmotic Shock）可以比較簡單地提取位于細胞周質中的蛋白。Osmotic Shock純化蛋白的原理是首先利用高濃度蔗糖溶液造成高滲透壓讓細胞收縮，然后用低濃度的硫酸鎂處理細胞，可以誘導在細胞周質的蛋白釋放，其成本低廉，操作簡單快速，為基因工程中蛋白純化提供了一條新思路。文獻多報道所使用的蔗糖濃度是20%，但不是所有的蛋白在20%的蔗糖濃度下都可以得到高質量的重組蛋白。鐵結合蛋白（Ferric-binding protein，F(xiàn)bpA）是位于革蘭氏陰性菌細胞周質中、與鐵代謝密切相關的蛋白，其分子量在37 ku左右[2-3]。該研究利用已經構建的帶有FbpA蛋白的T7啟動子表達質粒，轉化到EC感受態(tài)細胞，通過改變不同濃度的蔗糖，研究其對Osmotic Shock 純化蛋白產量的影響，探索Osmotic Shock 提純蛋白的最佳試驗條件，為今后開發(fā)以FbpA蛋白為前導序列引導融合蛋白進入細胞周質，進而純化蛋白提供資料。

1 材料與方法

1.1 載體與感受態(tài)細胞

該試驗的載體是已經構建好的T7啟動子系統(tǒng)，啟動子后面是EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點，接著是連續(xù)8個組氨酸標簽，TEV酶水解位點，F(xiàn)bpA基因，Hind III酶切位點，F(xiàn)bpA基因是927個堿基。表達產物包括組氨酸標簽、TEV酶水解位點以及FbpA基因，約43 ku。質粒的結構如圖1所示。感受態(tài)細胞是EC大腸桿菌菌株。

1.2 試劑

高滲溶液：將適量蔗糖溶解于pH 8.0 的30 mmol/L Tris溶液中，分別配制成含有20%、30%、40%、50%蔗糖的高滲溶液。

低滲溶液：5 mmol/L MgSO4溶液。

表達大腸桿菌培養(yǎng)基：轉化菌株的培養(yǎng)基按照參考文獻[4]進行，該培養(yǎng)基是Studier FW開發(fā)的一種免異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、可自動誘導的用于重組蛋白表達的專用培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 質粒載體的轉化與菌株培養(yǎng)。取實驗室保存的、經過純化的高質量質粒載體2 μL（約500 ng）加到在冰上融化的60 μL的EC感受態(tài)細胞中，用加樣槍吹打混勻，置于冰上30 min后，42 ℃水浴中熱休克2 min，然后再置于冰上3 min，加入LB液體培養(yǎng)基1 mL，37 ℃搖床中以180 r/min振蕩培養(yǎng)90 min后，加入含有80 mL表達用培養(yǎng)液的三角瓶中，180 r/min振蕩培養(yǎng)16～24 h。

1.3.2

Osmotic Shock純化蛋白。將80 mL培養(yǎng)物充分混勻，以每管20 mL分裝于50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，收集菌株，倒去上層培養(yǎng)基，4管分別加入10 mL含有20%、30%、40%和50%蔗糖的高滲溶液，用吸管反復吹吸菌體，使菌體充分打散，室溫搖晃10 min后，在4 ℃ 中4 000 r/min離心30 min，迅速倒去上清，將離心管倒置于紙巾中，徹底吸干多余的高滲溶液后，迅速加入1.5 mL 5 mmol/L的低滲MgSO4溶液，用吸管反復吹吸沉淀，打散菌體，然后置于冰上20 min后，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，小心吸取上清至1.5 mL離心管中，即為Osmotic Shock蛋白溶液。

1.3.3 電泳與染色。將前面4種蔗糖濃度下提取得到15 μL的蛋白溶液與15 μL蛋白上樣緩沖液混合，上樣SDS-PAGE，160 V電泳60 min，考馬斯亮藍染色5 min，脫色液洗脫背景，照相分析結果。

2 結果與分析

從圖2可以看出，各濃度蔗糖高滲液均能提取出蛋白質，出現(xiàn)的蛋白分子量在35 ku～48 ku，符合預期的片段大小。說明FbpA蛋白作為在細胞周質的蛋白，可以通過Osmotic Shock被很好地提取出來。

4種蔗糖濃度下，通過Osmotic Shock均能觀察到重組蛋白，從圖2可以看出，在30%、40%的蔗糖濃度下，蛋白產量最高，而蔗糖濃度為20%時，蛋白產量偏低，當蔗糖濃度達50%時，蛋白產量下降。

3 討論

用大腸桿菌表達的重組蛋白可以在細菌的細胞質中或者分泌到細胞周質中，也可以分泌到細胞外面。在細胞質中的蛋白，常以包涵體（Inclusion bodies）的形式存在，讓蛋白不能正確折疊，且破碎細胞常用到昂貴的裂解酶或專門的細胞破碎儀等復雜設備。而分泌到細胞外的蛋白需要很長的前導序列，增加了蛋白表達的難度。筆者研究了大腸桿菌表達周質蛋白，簡化提取純化步驟，并研究了Osmotic Shock法提取蛋白最佳的蔗糖濃度[5]。

從該研究來看，Osmotic Shock法提取大腸桿菌細胞周質的蛋白，可以得到純度和濃度都較高的重組蛋白，整個試驗流程只需要2～3 h，且不需要昂貴的儀器、設備和試劑。

從已有的文獻報道來看，多數(shù)使用的蔗糖濃度是20%。從該研究來看，提高蔗糖濃度可以進一步提高產量，但不是對所有蛋白都如此，因此在用Osmotic Shock法純化蛋白時，可以對所提取的蛋白進行蔗糖濃度試驗條件的優(yōu)化研究中，對于由FbpA介導的細胞周質蛋白，可以把Osmotic Shock的蔗糖濃度提高到40%。

Osmotic Shock只適用于細胞周質的蛋白；對于在細胞質里面的蛋白是不起作用的；對于細胞質的蛋白，可以用一些細胞周質蛋白的前導序列，幫助細胞質蛋白進入細胞周質，再用Osmotic Shock方法進一步釋放，這樣可以節(jié)約蛋白純化的時間與成本，提高蛋白的產量[6]。

參考文獻

[1] STEINER D，F(xiàn)ORRER P，STUMPP M T，et al.Signal sequences directing cotranslational translocation expand the range of proteins amenable to phage display[J].Nature biotechnology，2006，24（7）：823-831.

[2] FERREIRS C，CRIADO T M，GMEZ J A，et al.The neisserial 37 kDa ferric binding protein（FbpA）[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，1999，123（1）：1-7.

[3] WANG S P，OGATA M，HORITA S，et al.A novel model of ferric ion coordination by the periplasmic ferric ion-binding subunit FbpA of an ABC-type ion transport from Thermus thermophilus HB8[J].Acta Cryst，2012，70（1）：196-202.

[4] STUDIER F W.Protein production by auto-induction in high-density shaking culture[J].Protein Expr Purif，2005，41（1）：207-234.

[5] ZHOU Y Z，LIU P，GAN Y，et al.Enhancing full-length antibody production by signal peptide engineering[J].Microbial cell factories，2016，15：47.

[6] PAAL M，HEEL T，SCHNEIDER R，et al.A novel Ecotin-Ubiquitin-Tag（ECUT）for efficient，soluble peptide production in the periplasm of Escherichia coli[J].Microbial cell factories，2009，8：7-15.