饒澤兵，張娜，潘瑩，肖夢君，吳俊仙，陳允梓

(南京醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166)

·論 著·

維生素D對PDCD4表達(dá)的調(diào)控作用研究

饒澤兵，張娜，潘瑩，肖夢君，吳俊仙，陳允梓

(南京醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166)

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(BMDMs)分離和培養(yǎng) 將處死的B57小鼠用75%酒精浸泡2～3 min，晾干酒精放在盤上，小鼠后肢的皮毛脫至足部，剪下后肢放在培養(yǎng)皿中，去除肌肉，用鑷子提起股骨，在股骨大轉(zhuǎn)子關(guān)節(jié)處剪下股骨，放入培養(yǎng)皿中，用1 ml注射器取生理鹽水注入骨髓腔并沖洗2～3次，收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min。再用含10%L929細(xì)胞培養(yǎng)上清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并分到培養(yǎng)皿誘導(dǎo)分化。將其放入37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，收集培養(yǎng)上清，離心，用含10% L929細(xì)胞上清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞再鋪回培養(yǎng)皿，隔天換液，培養(yǎng)至第7天，貼壁細(xì)胞為小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 維生素D抑制PDCD4的mRNA表達(dá)

在BMDMs中，采用不同終濃度(0、2、20、200 nmol·L-1)的維生素D進(jìn)行刺激，24 h后收獲細(xì)胞，用實(shí)時定量PCR方法檢測PDCD4的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，PDCD4 mRNA水平隨著維生素D刺激濃度的升高而下降，變化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001,n=3)(圖1A)。再采用20 nmol·L-1維生素D刺激BMDMs，在不同時間點(diǎn)(0、8、16、24、32、48 h)檢測，結(jié)果顯示，PDCD4的mRNA表達(dá)水平與維生素D刺激時間呈負(fù)相關(guān)性，變化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,n=3)(圖1B)。以上結(jié)果說明了PDCD4 mRNA水平受維生素D負(fù)調(diào)控，并表現(xiàn)為劑量依賴以及作用時間的負(fù)相關(guān)。

A.不同劑量維生素D刺激的BMDMs中PDCD4的mRNA水平；B.維生素刺激BMDMs,在不同時間點(diǎn)PDCD4的mRNA水平；aP<0.05，bP<0.01

圖1 在原代BMDMs中，維生素D刺激對PDCD4 mRAN水平的影響

Fig 1 mRNA expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.2 維生素D抑制PDCD4蛋白表達(dá)水平

為進(jìn)一步確認(rèn)維生素D對PDCD4的調(diào)控，我們采用免疫印跡法檢測了PDCD4蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A，隨著維生素D濃度(0、2、20、200 nmol·L-1)的增加，PDCD4蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢，表現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系。同樣，采用20 nmol·L-1維生素D刺激細(xì)胞不同時間(0、8、24、48、72 h)后，PDCD4的蛋白表達(dá)水平隨著刺激時間延長而降低(圖2B)，與檢測的mRNA水平結(jié)果吻合。綜上所述，維生素D能夠抑制PDCD4的蛋白表達(dá)。

A.不同劑量的維生素D刺激的BMDMs中PDCD4蛋白水平；B.維生素刺激BMDMs,在不同時間點(diǎn)PDCD4的蛋白水平

圖2 維生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表達(dá)水平

Fig 2 Protein expression of PDCD4 with the stimuli of vitamin D in BMDMs

2.4 在LPS炎癥模型中維生素D對PDCD4表達(dá)的調(diào)控

為了更好地闡明維生素D的抗炎作用，我們采用LPS誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型。當(dāng)細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)條件下，采用維生素D進(jìn)行共刺激，然后檢測PDCD4的蛋白水平。結(jié)果如圖4所示，與LPS單獨(dú)刺激相比，LPS與VD共刺激能更顯著地抑制PDCD4的表達(dá)，說明炎癥情況下，維生素D能有效地抑制PDCD4的表達(dá)水平。

3 討 論

圖4 在LPS刺激的條件下，維生素D刺激的BMDMs中PDCD4的蛋白表達(dá)水平

Fig 4 Protein expression of PDCD4 with stimuli of LPS and vitamin D BMDMs

大量文獻(xiàn)報道維生素D在炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮著重要的作用[1- 2]。維生素D作為一種激素，具有檢測容易、易于補(bǔ)充和價格相對便宜等非常明顯的特征和優(yōu)勢，因此研究其在炎癥性疾病中的作用，將為預(yù)防、診斷和治療炎癥性疾病提供很大幫助。一系列的研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化[10]、心功能障礙[11]、糖尿病[12]等與炎癥相關(guān)的疾病中，PDCD4發(fā)揮重要作用，是潛在的調(diào)控炎癥性疾病的分子靶點(diǎn)。我們的研究表明，維生素D能夠有效抑制PDCD4的表達(dá)，并且能夠加強(qiáng)LPS對PDCD4的負(fù)調(diào)控，這將為深入了解維生素D在炎癥性疾病中的作用機(jī)制提供有效幫助。

Study on vitamin D in regulating PDCD4 expression in BMDMs

(BasicMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,China)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81371759)

R965

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