唐健新 區(qū)桂姍 蘇章軒 徐萬幫 梁生旺

1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510180； 3.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180

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柱后衍生-HPLC測定與分析沉香中黃曲霉毒素

唐健新1,2區(qū)桂姍1,2蘇章軒3徐萬幫3梁生旺1*

1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510180； 3.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180

目的：對沉香中黃曲霉毒素進行測定。方法：采用柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)，測定沉香中黃曲霉毒素的含量，了解所獲沉香中黃曲霉毒素污染情況。結(jié)果：按照《中國藥典》2015版的要求與指導原則， 69批次沉香樣品均未檢出黃曲霉毒素。結(jié)論：柱后衍生-HPLC聯(lián)用技術(shù)測定沉香中黃曲霉毒素方法可行，我國沉香黃曲霉毒素未受到黃曲霉毒素污染。

沉香；黃曲霉；柱后衍生-HPLC

黃曲霉毒素是真菌毒素中毒性最強的一種真菌毒素，具有極強的毒性和致癌性。在自然界中，無論是土壤、腐爛有機質(zhì)物品與植物纖維、農(nóng)產(chǎn)品或者其他食品上都有黃曲霉毒素存在。黃曲霉最適宜生存在相對濕度 85%左右的熱帶、亞熱帶地區(qū)并產(chǎn)生黃曲霉毒素。我國地域十分遼闊以及氣候的多樣性和復雜性導致我國中藥材和中藥飲片在加工、貯藏、運輸?shù)倪^程中，很容易發(fā)生霉變而導致被黃曲霉毒素污染。因此，檢測中藥材中黃曲霉毒素具有極其重要的意義[1-4]。

目前2015版《中國藥典》僅僅對少數(shù)幾種中藥材規(guī)定有關(guān)黃曲霉毒素含量的限度標準，如陳皮，胖大海等。沉香是我國的名貴中藥材之一，2016年廣東省通過立法保護廣東八種道地中藥材，沉香為其中之一。由于沉香主產(chǎn)越南、海南和廣東等熱帶和亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)的環(huán)境條件極易被黃曲霉等真菌類污染而產(chǎn)生黃曲霉毒素。因此，筆者擬采用柱后衍生與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)[5-8]，通過對沉香進行黃曲霉毒素測定，建立沉香中黃曲霉毒素含量測定的方法，為監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695/2475高效液相色譜儀及柱后衍生系統(tǒng)；色譜柱：Shim-pack CLC-ODS C18(150mm×6mm，5μm)、phenomenex gemini C18(250mm×4.6mm，5μm)、Thermo ODS-2 HYERSIL(200mm×4.6mm，5μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)； 離心機：Thermo Scientific Multifuge X1R1.2 材料 黃曲霉素混合對照品(批號:46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2純度分別為99.0%、99.0%、99.7%、99.5% ，Supelco Analitical)。甲醇、乙腈均為色譜純；水為試驗室自制去離子水。0.05%碘溶液：取0.5g碘，溶解在100mL甲醇中，用水稀釋至1000mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)。樣品：69批沉香樣品，來源于國家評價性抽驗,所有樣品均經(jīng)過本單位教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以甲醇-乙腈-水(22∶18∶60)為流動相，流速為1.0mL/min；衍生溶液為0.05%的碘溶液，衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃。熒光檢測器激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm。供試品溶液進樣量50μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密量取黃曲霉素混合對照品(B1、B2、G1、G2濃度分別為1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL)0.5mL，用甲醇定容至10mL，作為儲備液。精密量取儲備液1mL，用70%甲醇定容至25mL，搖勻，即得。2.2.2 供試品溶液的制備 取沉香藥材粉末2份，每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇75mL，超聲20min，離心5min(10000rpm)，精密量取上清液15mL，于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心5min(10000rpm)，用0.45μm孔徑的濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液20mL，通過免疫親和層析柱，流速2d/s，用20mL水分2次洗脫，棄去洗脫液，并通過約2mL空氣。用1.5mL甲醇分次洗脫，收集洗脫液，置2mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 回收溶液的制備 取沉香藥材粉末6份(批號：120921YF03)，每份10g，于錐形瓶中，精密稱定，加入0.2mL黃曲霉素混合對照品儲備液(B1、B2、G1、G2濃度分別為0.0495μg/mL、0.01485μg/mL、0.04985μg/mL、0.014925μg/mL)外，其余同試驗供試品溶液的制備方法。2.2.4 空白溶液的制備 精密量取2份經(jīng)檢驗無黃曲霉毒素的沉香樣品，每份10g，于錐形瓶中，其余同試驗供試品溶液的制備方法，制備空白溶液。

2.2.5 測定 按2015版《中國藥典》四部中，黃曲霉毒素測定法項下所述內(nèi)容進行操作和檢測。

2.3 方法學驗證

2.3.1 加樣回收率試驗 根據(jù)《中國藥典》四部有關(guān)要求可知：

試驗將1.3.3中所獲得的回收溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標準曲線法獲得沉香中黃曲霉毒素加樣回收率。如圖1所示。

分別記錄六次加標回收試驗色譜峰面積，根據(jù)公式1，計算相應的加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

從表1可知，黃曲霉毒素B1、G1回收率在70%～110%之間，黃曲霉毒素B2、G2回收率在75%～110%之間，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

2.3.2 精密度 以混合對照黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液為參照指標，對其進行精密度考察，精密吸取對照品溶液25μL，注入液相色譜儀，重復測定6次，即得。結(jié)果見表2。

從表2可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下精密度良好，相關(guān)的RSD為分別為1.01%、0.87%、1.09%和0.92%，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

表2 重復性試驗結(jié)果 (%)

2.3.3 專屬性考察 以制備的空白溶液為參照指標，對其進行專屬性考察，分別精密吸取空白溶液、對照品溶液和樣品溶液25μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。如圖2～4所示。

從圖2～4可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在上述色譜條件下空白無干擾，四種有效成分的分離度良好符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

2.3.4 線性關(guān)系采用逐步稀釋法，獲取系列不同濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的混合對照溶液25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)色譜峰面積和相應的稀釋倍數(shù)(濃度)，根據(jù)waters高效液相色譜儀自帶的處理程序，獲得相應的線性關(guān)系。見表3。

表3 方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

從表3可知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在指定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合2015版《中國藥典》四部中黃曲霉毒素測定法項下規(guī)定的要求。

2.4 耐用性的考察

2.4.1 不同色譜柱的考察 由于在測定的沉香樣品中沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣品，故采用對照溶液對不同色譜柱進行考察。照含量測定項下方法操作，采用四根不同規(guī)格的色譜柱測定對照溶液中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量，為了更好的體現(xiàn)色譜柱的性能比較，本次試驗以黃曲霉毒素B1為代表，分別從測定的含量、理論塔板數(shù)、分離度以及對稱因子四個方面對色譜柱進行比較，結(jié)果見表4。

表4 四根不同色譜柱的考察結(jié)果

從表4可知，四根不同的色譜柱均能有效分離與準確測定黃曲霉毒素B1。說明該方法的色譜柱要求不高，大部分色譜柱均能滿足對沉香樣品中黃曲霉毒素的測定。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取精密吸取黃曲霉毒素B1濃度為0.0198μg/mL的對照溶液25μL注入液相色譜儀，分別在0、8、13、18、25、30小時測定其含量，結(jié)果表明，樣品在30h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 方法檢出限 取對照品溶液(黃曲霉毒素B1濃度為0.00198μg/mL)，采用逐步稀釋法，并將逐步稀釋后的溶液，精密量取25μL注入色譜儀，記錄色譜圖。如圖5所示。

試驗以黃曲霉毒素B1的值為基準，用儀器自帶的計算軟件，當黃曲霉毒素B1信噪比約3.3：1，以此計算方法檢出限，符合儀器分析中儀器檢測限的相關(guān)要求。此時，以黃曲霉毒素B1計，沉香中黃曲霉毒素的檢測限約為0.2μg/kg。

2.5 樣品中黃曲霉毒素含量測定 采用上述方法，分別對所有69批次的沉香樣品進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定，結(jié)果均沒有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染。

3 結(jié)論

建立柱后衍生法測定沉香中黃曲霉毒素的方法，并對其進行方法學驗證，結(jié)果該表明方法良好。分別對所獲得的69批沉香樣品進行黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定，均沒有發(fā)現(xiàn)沉香樣品被黃曲霉毒素污染，說明我國沉香藥材受到黃曲霉毒素污染的風險較小。

[1]Congcong Ran, Dan Chen, Haiyan Ma, et al.Graphene oxide adsorbent based dispersive solid phase extraction coupled with multi-pretreatment clean-up for analysis of trace aflatoxins in traditional proprietary Chinese?medicines[J]. Journal of Chromatography B, 2017,s1044-1045:120-126.

[2]Lili Wang, Weijun Kong, Meihua Yang, et al.Safety issues and new rapid detection methods in traditional Chinese medicinal materials[J].Acta Pharmaceutica Sinica B,2015, 5(1): 38-46.

[3]Wu J C, Hseu Y C, Chen C H, et al. Comparative investigations of genotoxic activity of five nitriles in the comet assay and the Ames test [J]. J Hazard Mater. 2009(169): 492-497.

[4]Siu-Po Ip, Chun-Tao Che.Determination of aflatoxins in Chinese medicinal herbs by high-performance liquid chromatography using immunoaffinity column cleanup: Improvement of recovery[J].Journal of Chromatography A,2006, 1135 (2):241-244.

[5]Recep L, Dilek A, Yasin E, Muhsin K. Testing of the mutagenicity and genotoxicity of metolcarb by using both Ames/Salmonella and Allium test [J]. Chemosphere, 2010, 80(9): 1056-1061.

[6]Arimoto-Kobayashi S, Kayoko S, Masaki M, et al. UVA activation of N-dialkylnitrosamines releasing nitric oxide, producing strand breaks as well as oxidative damages in DNA, and inducing mutations in the Ames test [J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2010, 691(1/2): 47-54.

[7]L.K. Lee, K.Y. Foo.Recent advances on the beneficial use and health implications of Pu-Erh tea[J].Food Research International,2013(53):619-628.

[8]Cancer I AFO. Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. [J]. Carcinógenos ,1993.

唐建新，女，漢族，本科，主管藥師，研究方向為中藥安全性。E-mail:wbxu@163.com

梁生旺，男，漢族，本科，教授，研究方向為中藥質(zhì)量控制。

R284.1

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1007-8517(2017)11-0031-05

2017-03-24 編輯：梁志慶)