趙劍+李靜+李志+蒲清榮+黃銳+羅群

摘要：目的優(yōu)選柴黃清胰活血顆粒的最佳乙醇提取工藝。方法采用乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法和乙醇滲漉提取法，提取柴黃清胰活血顆粒中部分中藥材，用HPLC法測定其指標(biāo)性成分延胡索乙素的含量，選取延胡索乙素含量最高的提取方法作為柴黃清胰活血顆粒的乙醇提取工藝，并通過正交設(shè)計法優(yōu)選其最佳提取工藝。結(jié)果乙醇回流提取法與乙醇滲漉法提取的延胡索乙素含量較高，且含量相差不大，結(jié)合實踐，采用乙醇滲漉法提取延胡索乙素，其最佳滲漉提取工藝為：浸泡36 h，乙醇濃度55%，乙醇用量10倍，滲漉流速3 ml·min-1。結(jié)論該工藝客觀可行，穩(wěn)定合理，可為工藝生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滲漉提取法；正交設(shè)計；高效液相色譜；延胡索乙素；柴黃清胰活血顆粒

中圖分類號：R284文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2017）06-0074-03

【Abstract】Objective： To optimize the best ethanol extraction process of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule. Methods： Ethanol reflux extraction， ethanol ultrasonic extraction and ethanol percolation extraction were used to extract part of medicinal materials from Chaihuang Qingyi Huoxue Granule and HPLC was used to determine content of tetrahydropalmatine. The highest content extraction of tetrahydropalmatine was taken as ethanol extraction technology of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule， and its optimal extraction process was optimized by orthogonal design. Results： The ethanol reflux extraction and ethanol percolation extraction could extract higher amount of content with less different content. In practice， the ethanol percolation extraction was used to extract tetrahydropalmatine. The optimum extraction process was as follows： 36-hour soaking， 55% of ethanol concentration， 10 times of ethanol dosage， 3 ml·min-1 of percolation flow rate. Conclusion： The process is objective and feasible， stable and reasonable， which can provide a theoretical basis for its production.

【Key words】percolation extraction， orthogonal design， HPLC， tetrahydropalmatine， Chaihuang Qingyi Huoxue Granule

柴黃清胰活血顆粒是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院協(xié)定處方，主要由生大黃、柴胡、延胡索、丹參、梔子、黃芩、白芍等14味中藥組成。具有清熱解毒、活血消腫、通腑瀉熱、理氣止痛的功效，用于急性胰腺炎的治療。處方中延胡索所含有效成分延胡索乙素和丹參所含有效成分：丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、異隱丹參酮等成分，易溶于醇、醚等有機溶劑[1～2]。現(xiàn)代藥理研究證實，延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛抗炎作用，提高模型大鼠應(yīng)激能力，提高小鼠抗疲勞能力及耐缺氧能力等作用[3]。為了最大限度地提取上述中藥的有效成分，筆者考慮使用乙醇提取柴黃清胰活血顆粒的有效成分，采用70%乙醇回流提取、超聲提取和滲漉提取上述中藥材，用HPLC法測定其中指標(biāo)性成分延胡索乙素的含量，選取延胡索乙素含量最高的提取方法作為柴黃清胰活血顆粒的乙醇提取工藝，并通過正交設(shè)計法優(yōu)選其最佳提取工藝[4～5]。

1儀器與材料

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-20A紫外可見檢測器LCsolution色譜工作站；UltimateTM C18鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；JPGT0328超聲提取器（武漢嘉鵬電子有限公司），NRB17S3W電冰箱（日本松下）；HH數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；ZK072型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠）；AUW120D電子天平（日本島津）；延胡索乙素（購自中國藥品生物制品檢定所，批號110726-201516，供含量測定用）；延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、丹參（SALVIAE MILTIORRHIZAE RADIX ET RHIZOMA）均購于瀘州市天植中藥飲片公司，經(jīng)瀘州市藥檢所中藥室袁常珍主任鑒定均符合《中國藥典》2015年版相關(guān)要求；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果。

2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗UltimateTM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)PH值至6.4）（52：48），流速：1 mL·min-1，溫度：25℃，波長：280 nm，進樣量10 μL，在此條件下，延胡索乙素峰和供試品中其他相鄰組分色譜峰的分離度較好，按延胡索乙素峰計算，理論板數(shù)按延胡索乙素峰計算應(yīng)不低于3000[6～7]。

2.2對照品溶液的制備精密稱取延胡索乙素對照品7.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，得對照品母液，再取上述溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得濃度為0.0355 mg·mL-1對照品溶液

2.3線性范圍的考察分別精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，按擬定的色譜條件測定，將峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，計算得到回歸方程：Y=899714X+12003，R2=0.9998（n=5）表明對照品在0.0889～0.71 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好，見圖1-3。

2.4乙醇提取方法比較

2.4.1乙醇回流提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，置500 mL磨口燒瓶中，加熱回流提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得粗提物。

2.4.2乙醇超聲提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，置500 mL燒杯中，超聲提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得粗提物。

2.4.3乙醇滲漉提取法取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過10目篩），分別精密稱取延胡索20 g，丹參30 g，取70%乙醇400 mL，先用適量的乙醇浸泡30 min，使其均勻潤透，取脫脂棉一團，用浸泡液潤濕后墊在滲漉筒底部鋪平，裝筒，將剩余的乙醇加入，加蓋密閉24 h，以1 mL·min-1流速滲漉，收集完滲漉液，減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥，得干浸膏。

2.4.4準(zhǔn)確稱取上述3種干浸膏1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑（濃氨：甲醇=1：20）50 mL，稱定重量，冷浸1 h，加熱回流1 h，放至室溫，稱定重量，加甲醇補足損失重量，搖勻，濾過，即可得供試品溶液。各精密吸取10 μL，按2.1項下色譜條件進行測定，測定峰面積，計算胡索乙素含量。結(jié)果：乙醇回流提取法測得胡索乙素含量為0.8489 mg·g-1，乙醇超聲提取法測得胡索乙素含量為0.5864 mg·g-1，乙醇滲漉法測得胡索乙素含量為0.8318 mg·g-1。通過比較，乙醇回流提取法和乙醇滲漉法提取的胡索乙素含量相差不大，考慮到丹參中的丹參酮ⅡA的熱穩(wěn)定性較差[8]，故采用滲漉法作為乙醇提取工藝。擬采用正交設(shè)計，優(yōu)選乙醇滲漉法的最佳提取條件。

2.5乙醇滲漉工藝優(yōu)選以乙醇濃度、浸泡時間、加醇量、滲漉流速四因素、三水平，采用L9（34）正交試驗法安排實驗，以干浸膏、胡索乙素含量為指標(biāo)，優(yōu)選乙醇滲漉工藝最佳條件。取延胡索、丹參粉碎成粗顆粒（過10目篩），準(zhǔn)確稱取9份樣品，每份含延胡索20 g，丹參30 g。按表1中9種工藝條件組合進行滲漉提取，提取液減壓濃縮至少量，60 ℃恒溫干燥成干浸膏，備用。見表1。

2.6供試品溶液的制備 分別取9種試驗后的干浸膏各0.5 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入溶劑（濃氨：甲醇=1：20）50 ml，稱定重量，冷浸1h，加熱回流1h，放至室溫，稱定重量，加甲醇補足損失重量，搖勻，濾過，即可得供試品溶液。

2.7方法學(xué)考察

2.7.1精密度考查精密吸取延胡索乙素對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣5次，測定峰面積，RSD為1.01%，表明儀器精密度較高。

2.7.2穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，10 h按2.1項下色譜條件進樣，結(jié)果胡索乙素峰面積的RSD為0.62%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3重復(fù)性試驗取同一供試品溶液6份，分別按2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果胡索乙素峰面積的RSD為0.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.4加樣回收試驗取6份6號正交試驗干浸膏0.5 g精密稱定重量，精密加入對照品母液溶液（0.71 mg·mL-1）0.5 mL按2.6項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進行測定，計算胡索乙素峰的平均回收率，結(jié)果見表2。

2.8結(jié)果正交實驗安排與結(jié)果見表3，結(jié)果方差分析見表3-4。

通過直觀分析可知，各因素對乙醇滲漉提取工藝的影響順序為A>B>D>C。方差分析表明，A因素對胡索乙素轉(zhuǎn)移率影響顯著，其他因素則無顯著影響，結(jié)合生產(chǎn)實際考慮，確定其最佳提取工藝為A1B3C3D3，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度滲漉。

2.9工藝驗證按處方量稱取藥材3份，按選定的最佳提取工藝提取，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度滲漉，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果胡索乙素轉(zhuǎn)移率為：56.73%、57.21%、57.11%，表明該工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性較好。

3討論

本試驗粗略地比較了3種不同的乙醇提取方法，其中乙醇加熱回流提取工藝和乙醇滲漉工藝提取得到的胡索乙素含量最高。在大生產(chǎn)中，滲漉提取工藝既有較高的提取率，又能為生產(chǎn)企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本，是一種理想的提取工藝。

本實驗在選擇流動相時使用緩沖鹽溶液，分別對甲醇—緩沖鹽系統(tǒng)及乙腈—緩沖鹽系統(tǒng)進行色譜考察，甲醇—緩沖鹽溶液系統(tǒng)對色譜柱的壓力過高，容易對色譜柱造成損害，更對色譜圖造成誤差，因此不采用，使用乙腈—緩沖鹽系統(tǒng)，色譜峰峰形較好，分離度較高[9～10]。

由于9個實驗的出膏率不一樣，采用干浸膏中胡索乙素的含量作為數(shù)據(jù)分析的依據(jù)，結(jié)果沒有可比性，正交試驗方差分析數(shù)據(jù)也不準(zhǔn)確，所以本試驗采用胡索乙素的轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)。

3.4本試驗采用高效液相色譜法測定胡索乙素含量，分離效果好，操作簡便，穩(wěn)定性好，測定結(jié)果為優(yōu)選柴黃清胰活血顆粒乙醇滲漉提取工藝提供參考依據(jù)。為柴黃清胰活血顆粒進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

參考文獻：

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：666.

[2]黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994：586.

[3]范卓文，武斌，劉國臣.延胡索藥理研究及臨床應(yīng)用進展[J].黑龍江醫(yī)藥，2007，20（5）：522-524.

[4]趙劍，蒲清榮，陳玉蘭，等.茵陳四苓顆粒乙醇提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：31-34.

[5]曹德富，張圣賢，沈小琴，等.延胡索中延胡索乙素的提取工藝研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（6）：22-23.

[6]胡俊明.延胡索醇提工藝的優(yōu)選[J].中國醫(yī)藥指南，2015，13（33）：4-5.

[7]雷世庸，張榮發(fā).延胡索乙素的提取及含量測定方法研究進展[J].中國藥業(yè)，2009，18（16）：83-84.

[8]曾元兒，徐暉.烘干溫度和時間對丹參乙醇浸膏中丹參酮ⅡA含量的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，1997，8（1）：38-39.

[9]付延偉，程艷芹，紀(jì)松崗，等.胃樂舒顆粒的質(zhì)量控制[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（3）：209-212.

[10]林家壽.高效液相色譜法測定延胡索中延胡索乙素、延胡索丙素、小檗堿的含量及不同炮制品穩(wěn)定性研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，11（3）：348-351.