楊瑾+楊雪松

摘要：目的研究涼血解毒丸抗炎、抗敏的作用。方法采用2，4-二硝基氟苯（Dinitrofluobenzene 簡稱DNFB）造成變應性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis 簡稱ACD）動物模型和磷酸組胺致豚鼠瘙癢模型，探討“涼血解毒丸”的抗Ⅳ型變態(tài)反應作用。結果與模型組比較，涼血解毒丸組能顯著降低2，4-二硝基氟苯所致的小鼠耳廓腫脹度，能顯著抑制炎癥細胞浸潤和提高小鼠血清IL-10水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但是對IFN-γ的產生無明顯的影響（P>0.05）；涼血解毒丸能顯著止癢和增加磷酸酸組胺所致豚鼠瘙癢的致癢閾，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論涼血解毒丸對小鼠變態(tài)性接觸性皮炎有效，促進抗炎因子IL-10 的產生和表達可能是其治療機制之一，具有抗炎、抗敏的作用，無明顯毒副作用。

關鍵詞：涼血解毒丸；抗炎；抗敏；小鼠；豚鼠

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）06-0068-04

【Abstract】Objective： To study the anti-inflammatory and anti-allergic effects of Liangxue Jiedu Pill. Methods： 2， 4-dinitrofluobenzene （DNFB） was used to induce model guinea pig pruritus with allergic contact dermatitis （ACD） to study the anti-type Ⅳ allergic effect of Liangxue Jiedu Pill. Results： Compared with the model group， Liangxue Jiedu Pill group could significantly reduce the ear swelling of mice induced by 2，4-dinitrofluorobenzene， inhibit the infiltration of inflammatory cells and increase serum IL-10 level， and the difference was statistically significant （P<0.05）， but there was no significant effect on the production of IFN-γ （P>0.05）. Liangxue Jiedu Pill could significantly prevent itching and increase the itching threshold of histidine-induced guinea pig pruritus， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Liangxue Jiedu Pill is effective in mice with allergic contact dermatitis and can promote the production and expression of anti-inflammatory factor IL-10. It is one of its therapeutic mechanisms， anti-inflammatory and anti-allergic effect and no obvious side effects.

【Key words】Liangxue Jiedu Pill， anti-inflammatory， anti-sensitive， mouse， guinea pig

涼血解毒丸是在本院全國第三批名老中醫(yī)學術經驗繼承工作指導老師、云南省名老中醫(yī)劉復興教授自創(chuàng)的皮內2號方—荊芩湯的基礎上研發(fā)的中成藥制劑（批號：滇藥制字〈Z〉20082567A號，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心生產）。該方主要由荊芥、黃芩、生地黃、牡丹皮、赤芍等藥物組成，具有清熱解毒、涼血止癢之功，臨床主要用于治療中醫(yī)辨證屬血熱內蘊型的各類皮炎、濕疹及蕁麻疹、藥疹等多種變態(tài)反應性皮膚病[1][2]。涼血解毒丸具有明顯抗炎、抗敏止癢的作用，且無明顯毒副作用，然而其抗炎、抗敏的作用機理，如何延緩或控制變態(tài)反應性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展，通過何種途徑發(fā)揮作用，都尚不明確。本文通過建立2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致的小鼠耳廓腫脹模型，觀察涼血解毒丸對變應性接觸性皮炎小鼠炎癥細胞的抑制及對IL-10和IFN-γ表達的影響[2]，通過磷酸組胺致豚鼠瘙癢模型觀察其抗敏止癢的作用。從組織病理及分子生物學方面闡述其作用機制，為其臨床應用提供一定的理論及實驗依據(jù)，同時通過急性毒性實驗，觀察涼血解毒丸的毒副作用。

1實驗材料

1.1動物昆明種小白鼠，清潔級，30只，雌雄各半，體重18-22 g，合格證號：SCXK（滇）2005-0008；合格證號：0013106，由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供。健康豚鼠，清潔級，30只，雌雄各半，許可證號：SCXK（滇）2005-0008；合格證號：0021861。由昆明醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2藥物涼血解毒丸（批號：滇藥制字〈Z〉20082567A號），80 g/瓶，云南省中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。醋酸地塞米松片，0.75 mg/片，浙江仙琚制藥股份公司，國藥準字：H33020822，批號：130644。0.9%氯化鈉注射液，國藥準字H52020069，250 mL/瓶，貴州天地藥業(yè)有限責任公司出品，批號A13061504；馬來酸氯苯那敏片（撲爾敏片）：4 mg/片，昆明振華制藥廠有限公司，批號：20130501。0.9%氯化鈉注射液，國藥準字H52020069，250 mL/瓶，貴州天地藥業(yè)有限責任公司出品，批號A13061504。

1.3主要試劑及儀器小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒、小鼠IL-10ELISA 檢測試劑盒（深圳晶美生物有限公司提供）；磷酸組胺：成都艾科達化學試劑有限公司生產，批號：201305011，分析純。2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武漢福鑫化工有限公司，批號：201206012，分析純。8mm耳腫打耳器YLS-Q4，購自山東省醫(yī)學科學設備站。NewClassic MF電子分析天平：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）公司生產，顯微鏡、酶標儀，電動剃毛器等。

1.4給藥劑量

1.4.1涼血解毒丸劑量經人和動物的等效劑量系數(shù)換算，標準體重小鼠給藥劑量為11 mg/kg；標準體重豚鼠給藥劑量為5.5 mg/kg。

1.4.2醋酸地塞米松片給藥劑量參考文獻[2]方法，小鼠給藥劑量為0.01 g/kg。

1.4.3撲爾敏片給藥劑量參考文獻[3]方法，確定豚鼠給藥劑量為5.5 mg/kg。

1.4.4急性毒性實驗給藥劑量涼血解毒丸分別一次給藥劑量為200 mg/kg。

1.4.5主要試劑配制以4：l的丙酮：橄欖油配成0.5%、0.2%兩種濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2實驗方法

2.1涼血解毒丸對2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.1.1實驗動物分組、給藥與造模[2]健康昆明種小鼠，30只，雌雄各半，隨機（隨機數(shù)字表法）分成3組，分別為模型空白組，陽性對照組（醋酸地塞米松組），涼血解毒丸組。除模型空白組給予等體積生理鹽水外，參考文獻[3]方法，陽性藥組（醋酸地塞米松組）每日給藥量為0.01 g/kg，涼血解毒丸組按照人和動物的等效劑量系數(shù)計算，標準體重小鼠給藥劑量為11 mg/kg，每只動物按0.2 mL/10 g體質量灌胃，連續(xù)灌胃給藥7 d。實驗前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃須刀去毛，實驗第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μL，第3、4、5天不涂藥，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20 μL涂抹在小鼠左耳兩面進行免疫攻擊。右耳單涂丙酮：橄欖油（4：1）溶劑作為對照；涂耳24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳。

2.1.2觀察指標計算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

2.1.2.1小鼠耳片重量差小鼠處死后，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8mm的耳腫打耳器在耳中部打孔，取下相同大小的組織塊，稱取其重量。用分析天平稱得每個組織塊的重量。計算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

2.1.2.2病理變化及炎癥細胞計數(shù)[4]處死小鼠后，耳部皮損組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE 常規(guī)染色，光學顯微鏡下觀察各組病理變化，并用網型目鏡測微尺計數(shù)單 位面積真皮層最密集炎細胞浸潤區(qū)的多形核細胞及單一核細胞數(shù)（個/mm2）。

2.1.2.3檢測血清IL-10、IFN-γ水平[4]實驗結束后，摘除小鼠眼球，眼眶內取血，抗凝血在4℃下3000 r/min離心30 min，獲取血漿，利用ELISA檢測血漿中IL-10、IFN一γ的濃度。

2.2涼血解毒丸對磷酸組織胺致癢作用的影響

2.2.1目的了解涼血解毒丸對磷酸組織胺致癢作用的影響。

2.2.2分組、給藥、造模[5]與檢測指標豚鼠30只，雌雄各半，隨機（隨機數(shù)字表法）分為模型組，陽性對照組（撲爾敏組），涼血解毒組。除模型組給予等體積生理鹽水外，參考文獻[4]方法，撲爾敏陽性對照組灌胃給予撲爾敏（0.96 mg/kg）、涼血解毒丸組給予涼血解毒丸5.5 mg/kg灌胃，每只動物按1 mL/100 g體質量灌胃.連續(xù)給藥7 d。于第6天給藥后剔除各組豚鼠右后足背部的毛.第7天末次給藥后1 h內用砂紙分別擦傷各組豚鼠右后足背部剃毛處，面積約1 cm2。于末次給藥1 h后開始分別在各組豚鼠右后足創(chuàng)傷處滴0.01%組胺磷酸溶液0.05 mL。此后每隔3min分別依次遞增組胺的濃度（0.01%、0.02%、0.03%），每只每次滴0.05 mL，直至豚鼠出現(xiàn)回頭舔右足時，停止實驗，記錄磷酸組胺的滴加次數(shù)，換算成磷酸組胺滴加總量。

2.2.3統(tǒng)計方法使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料均使用（x±s）表示。兩獨立樣本的計量資料比較若呈正態(tài)分布，并具有總體方差齊性，則采用t檢驗，若不具有總體方差齊性，則使用t檢驗。兩組以上數(shù)據(jù)比較若具有總體方差齊性則采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；兩組以上數(shù)據(jù)比較若不具有總體方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，兩兩比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗。以上統(tǒng)計方法，均以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

3實驗結果

3.1涼血解毒丸對2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響見表1。

3.23組小鼠白血清IL-10水平比較見表2。

3.33組小鼠炎癥細胞計數(shù)、IFN-γ水平比較見表3。

3.43組對磷酸組織胺致癢作用的影響見表4。

3.5急性毒性試驗對照組和涼血解毒丸組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血解毒丸無毒副作用，安全有效。

4討論

該研究通過用DNFB建立小鼠ACD模型，把小鼠耳廓作為皮炎的靶部位，通過炎癥細胞計數(shù)和對細胞因子的影響來觀察藥物的抗炎作用。

涼血解毒丸和醋酸地塞米松連續(xù)灌胃給藥7 d后，組織學檢查示涼血解毒丸和地塞米松均可明顯抑制小鼠右耳中單一核細胞、中性粒細胞浸潤和充血水腫，說明涼血解毒丸與醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用，但涼血解毒丸的抗炎作用并不優(yōu)于醋酸地塞米松。

在對細胞因子IL-10產生影響的實驗中，陽性藥地塞米松和涼血解毒丸藥物均顯著提高具有免疫抑制活性細胞因子IL-10的產生水平，提示地塞米松和涼血解毒丸均通過提高細胞因子IL-10的產生水平來達到抗炎的作用，但涼血解毒丸并不優(yōu)于醋酸地塞米松。在對IFN-γ產生影響的實驗中，地塞米松組IFN-γ產生顯著減少，差異有顯著性意義（P<0.01），然而涼血解毒丸對小鼠細胞因子IFN-γ產生無明顯的影響（P>0.05），說明地塞米松通過降低IFN-γ的水平，進而發(fā)揮抗炎癥作用，但涼血解毒丸對IFN-γ水平的影響不顯著。

在炎癥過程中產生的細胞因子可分為5類，其中IL-10是免疫反應的負調節(jié)因子，能減少LPS和IFN-γ誘導的單核/巨噬細胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性細胞因子，促進抗炎介質如可溶性TNFR的釋放，還可抑制CD4+T細胞的增值和細胞因子的分泌，包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5，同時還可抑制中性粒細胞合成和釋放促炎介質[6]。而IFN-γ屬于激活巨噬細胞的細胞因子，可誘導加重炎癥[1]。

瘙癢是變態(tài)反應性皮膚疾病常見癥狀之一，其發(fā)病機制研究尚不完全清楚，可能與諸多因素有關，有大量研究表明，組胺是一種可以引起皮膚瘙癢的重要介質[1]，主要儲存在嗜堿粒細胞和肥大細胞的顆粒內。實驗采用外源性組胺誘發(fā)豚鼠瘙癢的方法，與模型組比較，豚鼠局部致癢閾值明顯提高（P<0.05），提示涼血解毒丸有抗瘙癢的作用。

涼血解毒丸臨床應用已10多年，現(xiàn)代藥理學研究證明其組方中的黃芩、丹皮、赤芍、紫草、荊芥均有一定的抗炎作用，對I、II、III和Ⅳ變態(tài)反應均有抑制作用，對白介素、IFN-γ等細胞因子的表達水平均有影響[7][8]，為組方的合理性提供了一定現(xiàn)代藥理學依據(jù)，但中藥復方通常作用于機體多靶點、多環(huán)節(jié)，是個復雜系統(tǒng)，故有必要進一步深入研究，闡明其抗炎的作用機制，并通過急性毒性試驗從科學角度驗證其毒副作用。

通過以上的研究表明，涼血解毒丸具有較為明確的抗炎作用，促進抗炎因子IL-10 的產生和表達可能是其治療機制之一；其抗敏止癢的機制可能與抑制肥大細胞脫顆釋放組胺等炎癥介質，產生了類似H1受體拮抗劑的作用，從而抑制了組胺與靶點的相互作用有關。

參考文獻：

[1]趙辨.臨床皮膚病學[M].南京：江蘇科學技術出版社，2009：0726.

[2]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：28.

[3]趙杰，余林中，方芳，等.麻黃-甘草藥對的抗炎作用及機制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（15）：164.

[4]蘇向陽，季雙雙，賴維.變應性接觸性皮炎免疫學發(fā)病機制研究進展[J].國際皮膚性病學雜志，2011，37（3）：158-160.

[5]張婷，葉建州，唐浩然，等.傣藥“雅解沙把"抗變態(tài)反應的實驗研究[J].云南中醫(yī)學院學報，2012，35（2）：5-6.

[6]朱平，杜小萍，鞠吉雨.IL-10與疾病關系的研究進展[J].國際免疫學雜志，2012，35（1）：14-17.

[7]楊正生，楊會君，王亞斐，等.丹皮酚對小鼠變應性接觸性皮炎Th1/Th2分子表達的影響[J].山西醫(yī)科大學學報，2012，43（12）：914-917.

[8]劉欣，李萍，趙京霞，等.涼血活血膠囊全方及拆方對Jurkat T淋巴細胞增殖、活化及釋放細胞因子的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（22）：198-202.