叢艷君，陳 澍，李 曄，于曉鳳，李林峰

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050）

牛乳α-乳白蛋白IgE線性表位的關(guān)鍵氨基酸識(shí)別

叢艷君1，陳 澍1，李 曄1，于曉鳳1，李林峰2

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；2.北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050）

α-乳白蛋白是引起牛乳過敏的主要過敏原之一。識(shí)別α-乳白蛋白作用表位及影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，對(duì)于揭示α-乳白蛋白致敏機(jī)理及低致敏乳制品的開發(fā)具有重要的意義。本研究采用固相合成技術(shù)合成α-乳白蛋白系列多肽，以牛乳過敏患者血清為探針，通過酶聯(lián)免疫吸附分析法識(shí)別α-乳白蛋白的作用表位和關(guān)鍵氨基酸。結(jié)果表明：免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）E作用表位的氨基酸序列定位為aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115。α-乳白蛋白IgE作用表位關(guān)鍵氨基酸為第8位的纈氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位組氨酸。本研究可以為過敏原cDNA克隆以激活T細(xì)胞、降低IgE結(jié)合能力提供重要思路。

牛乳過敏；α-乳白蛋白；作用表位；關(guān)鍵氨基酸

牛乳過敏（cow milk allergy，CMA）是一種常見的疾病，它通常是暫時(shí)性的，2 歲以下兒童的發(fā)生率為2.5%[1]。大多數(shù)嬰幼兒在3～4 歲時(shí)開始對(duì)牛乳產(chǎn)生耐受，不再受過敏癥困擾，但是，仍然有15%的由免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）E介導(dǎo)的患有CMA癥的嬰幼兒持續(xù)這種疾患[2]。

牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白，分別占總蛋白含量的80%和20%。其中，最主要的過敏原為αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）。ALA是一種球蛋白，由123 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為14 200，有4 個(gè)二硫鍵[3]。同源性研究表明牛乳與人乳中的ALA同源性為74%，另有6%的氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)相似。ALA與鈣有較高的親和力，使之二級(jí)結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定。根據(jù)ALA親水區(qū)域推測(cè)其主要的抗原結(jié)合位點(diǎn)位于肽鏈第5～18位的氨基酸片段，與BLG分子中氨基酸序列124～134具有同源序列[4]。

表位是抗原中能夠被B細(xì)胞和T細(xì)胞識(shí)別的氨基酸序列，分為IgE作用表位和IgG作用表位。作用表位的識(shí)別對(duì)于開發(fā)特異性更強(qiáng)的CMA診斷方法具有重要的理論意義。本研究中，將能被65%以上過敏患者血清識(shí)別的多肽定義為作用表位[5-6]。

對(duì)其他食物過敏原（比如花生過敏原Ara h1、Ara h2和Ara h3）的基因突變分析報(bào)告表明，用丙氨酸依次替換每個(gè)IgE結(jié)合表位的單個(gè)的氨基酸可以顯著降低花生過敏患者血清IgE抗體與花生過敏原結(jié)合的能力[7-9]。本課題組之前的研究找到了影響B(tài)LG和αs1-酪蛋白致敏性的IgE和IgG作用表位的關(guān)鍵氨基酸殘基[10-11]。

本研究以嬰幼兒CMA患者血清為探針識(shí)別ALA的IgE作用表位，在此基礎(chǔ)上，通過丙氨酸掃描方法即用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽，然后用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法識(shí)別降低ALA致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ALA、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的鼠抗人IgE（ε鏈特異性）、4-氯-1-萘酚、三氟乙酸美國Sigma公司；96 孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 美國Costar公司；ALA多肽由北京食品添加劑與配料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成。

1.2 儀器與設(shè)備

550型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；PSH500A生化培養(yǎng)箱 中國重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Th-80D-2B型凍干機(jī) 北京天地精儀科技有限公司；高效液相C18柱美國Vydac公司；PSI200多通道多肽合成儀 美國多肽科技有限公司 。

1.3 方法

1.3.1 CMA患者血清的收集

ALA CMA患者血清及陰性血清由北京友誼醫(yī)院提供。8 例CMA患者（6 個(gè)月～3 歲，平均年齡為1 歲）血清用來鑒別IgE表位和這些表位上的關(guān)鍵氨基酸。通過ALA試劑盒、免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定8 例血清ALA特異性IgE抗體含量為25～100 kU/L。8 例CMA患者的臨床癥狀表現(xiàn)為特異性皮炎。5 位非CMA癥幼兒（1～3 歲）的血清用作陰性對(duì)照。

1.3.2 ALA多肽的合成、純化及鑒定

1.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)獲取 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116瞬轉(zhuǎn)miR-1254模擬體后24 h，通過TRIzol?提取細(xì)胞全RNA，干冰保存送檢北京貝瑞和康公司測(cè)序。

以ALA氨基酸序列為模板，用9-芴甲氧羰基（fiuorenylmethoxy carbony，F(xiàn)moc）固相合成法錯(cuò)位合成系列ALA多肽（長度為15 個(gè)氨基酸）[12]。

合成的多肽通過C18反向高效液相色譜純化，以0.1%三氟乙酸-水和0.1%乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為12.0 mL/min，上樣量為50 mg/mL的合成肽。通過質(zhì)譜測(cè)定多肽分子質(zhì)量鑒定合成多肽的準(zhǔn)確性，質(zhì)譜條件為：ESI離子源；噴霧壓力：15 psi；干燥氣溫度：350 ℃；流速：5 L/min；掃描質(zhì)量范圍：m/z 500～2 200。

1.3.3 IgE作用表位和關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別

參考Cocco等[13]的研究方法，通過直接ELISA識(shí)別IgE作用表位和關(guān)鍵氨基酸。首先將連接鏈霉親和素的ALA多肽加入到96 孔酶標(biāo)板中4 ℃包被12 h。洗滌后，用含1%牛血清白蛋白的Tris緩沖溶液封閉，之后加入個(gè)體血清用以識(shí)別IgE作用表位或者加入混合血清用于識(shí)別關(guān)鍵氨基酸，個(gè)體血清、混合血清均用含1%牛血清白蛋白的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液以1∶10稀釋。以HRP標(biāo)記的單克隆鼠抗人IgE為二抗，用含1%牛血清白蛋白的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液以1∶2 000稀釋。4-氯-1-萘酚為顯色液，450 nm波長處檢測(cè)其OD值。以非CMA患者血清作為對(duì)照。

將被65%以上CMA患者個(gè)體血清IgE識(shí)別的多肽定義為作用表位。將被丙氨酸取代而導(dǎo)致失去致敏性的氨基酸稱為關(guān)鍵氨基酸。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用微軟Excel 2010軟件進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行。數(shù)據(jù)間的差異水平使用ANOVA進(jìn)行分析，以Kruskal-Wallis檢驗(yàn)置信水平，95%作為顯著水平。ALA的三維結(jié)構(gòu)圖用Pymol軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽合成

表1 基于ALA序列合成的多肽Table 1 A series of peptides synthesized based on the sequence ofα-lactalbumin

由表1可知，合成了23 條多肽，屬于ALA大部分氨基酸序列區(qū)域，這些多肽的純度均在85%以上，用于識(shí)別ALA IgE作用表位。

2.2 IgE作用表位的識(shí)別

表2 ALA IgE作用表位Table 2 IgE-binding epitopes ofα-lactalbumin

由表2可知，用8 位CMA患者血清識(shí)別多肽，其中編號(hào)為P1的多肽（aa1-15）和編號(hào)為P21的多肽（aa101-115）的識(shí)別率為100%（8/8，即與8 份血清均發(fā)生特異性反應(yīng)）。P2（aa6-20）和P10（aa46-60）的識(shí)別率為87.5%（7/8）。P15（aa71-85）的識(shí)別率為75%（6/8）。P11、P14、P20和P22的識(shí)別率為37.5%（3/8）。多肽P3、P4、P6、P7、P8、P9、P12、P13、P16、P17、P18、P19和P23與血清也發(fā)生了免疫反應(yīng)，多肽P5未與血清發(fā)生免疫反應(yīng)。識(shí)別率在65%以上的多肽為作用表位。表2中以灰度深淺表示免疫反應(yīng)程度強(qiáng)弱。因此IgE的作用表位在ALA氨基酸序列中的定位為aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115，在ALA三維結(jié)構(gòu)中的位置見圖1。非CMA患者血清識(shí)別多肽表現(xiàn)為弱反應(yīng)（本實(shí)驗(yàn)未附陰性對(duì)照的具體數(shù)據(jù)）。

圖1 ALA的三維結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 3D structure of α-lactalbumin

2.3 ALA IgE作用表位（aa1-15和aa101-115）關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別

用丙氨酸依次取代aa1-15肽段上的氨基酸合成多肽，以8 名CMA患者的混合血清為抗體通過ELISA識(shí)別新合成的多肽，以aa1-15為對(duì)照，450 nm波長處測(cè)定OD值（圖2），第8位的纈氨酸，第9位的苯丙氨酸，第10位的精氨酸分別被丙氨酸取代后合成的多肽（V8A、F9A、R10A）OD值為0，多肽致敏性消失。其他絕大多數(shù)氨基酸被丙氨酸取代后的多肽OD值與對(duì)照（aa1-15）差異不顯著。

圖2 降低作用表位aa1-15致敏性的關(guān)鍵氨基酸識(shí)別Fig. 2 Single amino acid change in the peptide at aa1-15 resulted in the loss of IgE binding to this epitope

同樣方法確定aa101-115肽段上關(guān)鍵氨基酸，結(jié)果見圖3。第103位的酪氨酸，第105位的亮氨酸和第107位的組氨酸分別被丙氨酸取代后合成的多肽（Y103A、L105A、H107A）OD值為0，多肽致敏性消失。其他絕大多數(shù)氨基酸被丙氨酸取代后的多肽OD值與對(duì)照組（aa101-115）差異不顯著。

基于以上實(shí)驗(yàn)，得出第8位的纈氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位的組氨酸是影響ALA致敏性的關(guān)鍵氨基酸，這些氨基酸殘基的空間位置如圖1所示。

圖3 降低作用表位aa101-115致敏性的關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別Fig. 3 Single amino acid change in the peptides at aa101-115 resulted in reduced IgE binding to this epitope

3 結(jié)論與討論

國外對(duì)牛乳過敏原作用表位識(shí)別的研究開展比較早，J?rvinen等[14]收集了持續(xù)性CMA患者血清和暫時(shí)性CMA患者血清識(shí)別ALA作用表位，用持續(xù)性CMA患者識(shí)別到4 個(gè)IgE作用表位和3 個(gè)IgG作用表位，而暫時(shí)性CMA患者血清沒有識(shí)別到作用表位。Hochwallner等[15]重組的ra-乳白蛋白能夠被57.6%的CMA病人識(shí)別，可以用于診斷嚴(yán)重的CMA患者。同時(shí)對(duì)αs1-酪蛋白和BLG開展的研究也得出類似結(jié)論，即不同臨床癥狀病人血清識(shí)別的作用表位不同[6,16-21]，這為臨床CMA的診治提供了重要思路。本課題組在前期用對(duì)CMA的臨床癥狀為濕疹的患者血清識(shí)別αs1-酪蛋白IgE和IgG作用表位，發(fā)現(xiàn)具有同一癥狀病人血清識(shí)別的IgE作用表位相同，而IgE和IgG作用表位不同，進(jìn)而對(duì)BLG作用表位也行了研究，同樣驗(yàn)證了上述結(jié)論[10-11]。

本研究目的在于建立ALA序列中抗原表位模型，探究降低過敏原致敏性的關(guān)鍵氨基酸，為ALA序列表位的識(shí)別模式與特異性皮炎臨床癥狀之間的關(guān)系提供理論依據(jù)，并針對(duì)ALA的線性表位，對(duì)ALA構(gòu)象表位的鑒定是該研究未來要做的工作。

盡管Adams等[22]以ALA的胰蛋白酶的裂解物為研究對(duì)象，而本研究基于ALA的序列合成不同的多肽，但是識(shí)別到了同一個(gè)作用表位aa1-15，另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了IgE其他結(jié)合表位在aa101-115、aa6-20、aa46-60和aa71-85，識(shí)別到不同作用表位的原因可能與過敏患者遺傳背景及血清學(xué)不同有關(guān)。那些沒有被病人血清識(shí)別的多肽，推測(cè)其可能位于ALA核心部位的疏水區(qū)域。

Adams等[22]通過RAST實(shí)驗(yàn)證明了aa5-18肽段表現(xiàn)出較強(qiáng)的IgE結(jié)合能力，用胰蛋白酶消化ALA的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，aa17-58多肽序列更加容易被IgE識(shí)別。此外，多肽aa59-94、aa6-10、aa115-123和aa109-123與牛乳患者血清IgE較強(qiáng)的結(jié)合能力也被報(bào)道過[23]。基于以上結(jié)果，并結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，代表性的研究了aa1-15，aa101-115作用表位的關(guān)鍵氨基酸。

由于丙氨酸為分子質(zhì)量相對(duì)較小的中性氨基酸，并且不會(huì)顯著改變肽的電荷和溶解度，所以我們選用丙氨基作為取代氨基酸，這種方法已成功地用于其他過敏原關(guān)鍵氨基酸的分析[24-25]。IgE作用表位關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別，可以為ALA的基因編碼、降低過敏原的IgE結(jié)合能力提供重要的信息。本研究結(jié)果表明，修飾IgE結(jié)合表位aa1-15肽段上的第8位的纈氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸可以降低ALA的致敏性。另外，第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位的組氨酸也是影響作用表位aa101-115致敏性的關(guān)鍵氨基酸。并且，IgE結(jié)合表位主要由疏水性氨基酸構(gòu)成，且至少包含一個(gè)賴氨酸[28-29]，本研究中也得出了類似的結(jié)論。

通過“丙氨酸掃描技術(shù)”識(shí)別了降低ALA過敏原致敏性的關(guān)鍵氨基酸。第8位的纈氨酸，第9位的苯丙氨酸，第10位的精氨酸，第103位的酪氨酸，第105位的亮氨酸和第107位的組氨酸是IgE結(jié)合表位的關(guān)鍵氨基酸。本研究結(jié)論為蛋白質(zhì)氨基酸定點(diǎn)修飾、基因工程技術(shù)重組過敏原蛋白以降低致敏性提供了重要的信息。此外，那些沒有被IgE識(shí)別的氨基酸，也可以為過敏原的基因沉默研究提供思路。

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Identification of the Critical Amino Acids of IgE-Binding Epitopes in α-Lactalbumin

CONG Yanjun1, CHEN Shu1, LI Ye1, YU Xiaofeng1, LI Linfeng2
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, College of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Department of Dermatology, Beijing Friendship Hospital, Beijing 100050, China)

α-Lactalbumin represents one of the major allergens causing cow milk allergy. The identification of the epitopes of α-lactalbumin and the critical amino acids for its allergenicity is of great significance for understanding the mechanism of action of α-lactalbumin and developing hypoallergenic dairy products. In this study, a series of peptides were synthesized by a solid phase method for the characterization of immunological epitopes and critical amino acids. The immunoglobulin (Ig) E-binding epitopes were immunolabeled with individual sera from cow milk-allergic patients as probes by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Alanine scanning of immunodominant epitopes was used to identify the critical amino acids (aa). The results showed that IgE-binding epitopes were located within the sequences of aa1-15, aa6-20, aa46-60, aa71-85 and aa101-115. Our initial data revealed that Val8, Phe9, Arg10, Tyr103, Leu105and His107were the critical amino acids for IgE-binding epitopes. This study will provide the necessary information to alter the cDNA to encode a protein capable of activating milk-specific T cells, but with reduced IgE-binding capacity.

cow milk allergy; α-lactalbumin; epitope; critical amino acid

10.7506/spkx1002-6630-201711001

TS252.1

A

1002-6630（2017）11-0001-05

叢艷君, 陳澍, 李曄, 等. 牛乳α-乳白蛋白IgE線性表位的關(guān)鍵氨基酸識(shí)別[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(11): 1-5. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201711001. http://www.spkx.net.cn

CONG Yanjun, CHEN Shu, LI Ye, et al. Identification of the critical amino acids of ige-binding epitopes in α-lactalbumin[J]. Food Science, 2017, 38(11): 1-5. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711001. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101236）；北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（6132004）；北京市科技新星計(jì)劃項(xiàng)目（Z131102000413005）

叢艷君（1978—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：cyj_win@sina.com