高薇薇 盧文翔 張雷 白云飛

寧波地區(qū)非綜合征型耳聾患兒耳聾基因熱點突變篩查分析

高薇薇 盧文翔 張雷 白云飛

目的 篩查分析寧波地區(qū)非綜合型耳聾(NSHL)患兒耳聾基因熱點突變情況，了解該地區(qū)耳聾患兒分子流行病學(xué)特征。方法 選取寧波市特殊教育中心就讀的重度、極重度NSHL患兒168例，應(yīng)用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，采用多重突變阻滯擴增系統(tǒng)毛細管電泳檢測技術(shù)進行4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變篩查。 結(jié)果 本研究NSHL患兒中檢出耳聾基因熱點突變58例（34.52%），其中單一GJB2基因熱點突變者43例，單一SLC26A4基因熱點突變者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因熱點突變者3例，12S rRNA基因熱點突變3例；GJB2、SLC26A4、12S rRNA基因熱點總突變率分別為27.38%、7.14%和1.79%。在所有熱點突變中，以GJB2 235delC突變率最高（23.21%），其次是GJB2 299 del AT（5.36%）。 結(jié)論 寧波地區(qū)NSHL患兒熱點突變耳聾基因以GJB2基因和SLC26A4基因為主，且GJB2 235delC是最常見突變位點。

遺傳性耳聾 非綜合征型耳聾 熱點突變 基因診斷

我國每年患各種出生缺陷和先天殘疾的新生兒中，聽力殘疾是最常見，也是最嚴(yán)重的，其中遺傳因素導(dǎo)致的聽力殘疾超過半數(shù)。遺傳性耳聾按表型不同可分為綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）。NSHL是指只有聽力損害，不伴有耳外組織的異常和病變，約占遺傳性耳聾的70%。國內(nèi)大規(guī)模的耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，在NSHL患者中存在幾個熱點突變：GJB2基因突變、GJB3基因突變、線粒體12S RNA和SLC26A4基因突變[1]。這些熱點突變的發(fā)現(xiàn)為我國開展耳聾基因突變的篩查、診斷及阻斷提供了理論基礎(chǔ)。本研究對寧波地區(qū)NSHL患兒進行了4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變篩查，以了解該地區(qū)NSHL患兒耳聾基因熱點突變譜系及發(fā)生頻率，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年7月至2016年12月在寧波市特殊教育中心及其附屬幼兒園（鄞州區(qū)小雨點聽力語言康復(fù)中心）就讀的具有完整聽力學(xué)資料的重度、極重度耳聾患兒168例，排除各類SHL及急慢性中耳炎、聽神經(jīng)性瘤、耳外傷等有明顯原因致聾的患兒。經(jīng)問卷調(diào)查及體格檢查，全部患兒為NSHL，其中男87例，女81例；年齡3～16（11.22±4.10）歲。本研究患兒均接受了耳聾基因檢測，并取得患兒及患兒家長的知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 AGCU遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），磁珠法DNA提取試劑盒（長春市博坤生物科技有限公司），去離子甲酰胺（美國ABI公司），POP4膠（美國ABI公司），Life Pro擴增儀（杭州博日科技有限公司），3130XL型遺傳分析儀（美國ABI公司）。

1.2.2 DNA樣本的采集 先在干凈的15ml離心管上空白位置和管蓋上作好耳聾患兒代號標(biāo)記。耳聾患兒在取樣前30min內(nèi)停止進食。采樣人員用消毒棉簽輕輕刮取患兒口腔舌下及雙側(cè)頰黏膜口腔上皮細胞，輕輕地旋轉(zhuǎn)或刮動10次左右以保證獲得足夠的DNA，采集過程中注意避免用手觸及棉簽；采集完成后置于空氣中風(fēng)干片刻，再放回離心管并封口。

1.2.3 檢測方法 采用磁珠法提取DNA。每例棉簽樣本用小剪刀剪取少量，可被150μl裂解液淹沒即可，提取的DNA直接用于PCR擴增。PCR擴增體系組成：Reaction Mix 5.0μl+Primers 2.0μl+熱啟動C-Taq酶0.3μl+模板（磁珠法提取）1.0μl+sdH2O 1.7μl。PCR擴增程序：預(yù)變性95℃5min，94℃1min、60℃1min、72℃1min（循環(huán)30次），終延伸72℃20min。

1.2.4 熱點突變篩查 采用多重突變阻滯擴增系統(tǒng)毛細管電泳檢測技術(shù)篩查。取1μl PCR產(chǎn)物與10μl去離子甲酰胺和AGCU Marker SIZ-500混合物混勻，采用3130XL型遺傳分析儀檢測（進樣電壓3KV，時間10s），結(jié)果采用GeneMapper v3.2軟件進行分析。篩查4個遺傳性耳聾基因的29個位點的突變，包括GJB2基因（9、35、167、176、235、299、155、424、512）、GJB3基因（538、547）、SLC26A4基因（281、589、707、IVS7－2、1174、1226、1229、1238、1336、1548、1829、1975、IVS15+5、2027、2168）和12S rRNA基因（1494、1555、12201）。

2 結(jié)果

2.1 168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析 本研究NSHL患兒中檢測到耳聾基因熱點突變者58例（34.52%），其中單一GJB2基因熱點突變者43例，單一SLC26A4基因熱點突變者9例，GJB2基因合并SLC26A4基因熱點突變者3例，12S rRNA基因熱點突變3例。GJB2基因熱點總突變率為27.38%（46/168），SLC26A4基因熱點總突變率為7.14%（12/168），12S rRNA基因熱點總突變率1.79%（3/168）。在上述所有熱點突變中，GJB2 235delC突變率最高，為23.21%（39/168）；其次是GJB2 299 del AT，為5.36%（9/168）；SLC26A4 1226G＞A、2168A＞G以及12S rRNA 1555A＞G突變率均為1.79%（3/168）；本研究患兒未檢出GJB3基因突變。168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析見表1。

表1 168例NSHL患兒耳聾基因熱點突變分析

2.2 58例耳聾基因突變NSHL患兒突變熱點分析 由表2可見，46例GJB2基因熱點突變NSHL患兒中GJB2基因單個熱點突變的患者39例，分別為235delC純合突變21例，235delC雜合突變11例，299-300delAT雜合突變5例，176del16雜合突變1例，35delG雜合突變1例；GJB2基因2個突變熱點的患者4例，分別是299delAT/235delC復(fù)合雜合突變3例，176del16、235delC復(fù)合雜合突變1例；GJB2基因與SLC26A4基因復(fù)合突變的患者3例，分別是GJB2 235delC純合突變合并SLC26A4 1180delTTC雜合突變1例，GJB2 235delC雜合突變合并SLC26A4 2168A＞純合突變1例，GJB2 299delAT/235delC雜合突變合并SLC26A4 2168A＞G雜合突變1例。

12例SLC26A4基因熱點突變NSHL患兒中，與GJB2基因復(fù)合突變3例，SLC26A4基因單一熱點突變9例：919A＞G純合突變1例，1975G＞C純合突變1例，雜合突變1例，1226G＞A雜合突變3例，2168A＞G雜合突變1例，1229C＞T雜合突變2例。

3例 12S rRNA基因熱點突變 NSHL患兒中，1555A＞G均質(zhì)性突變2例，1555A＞G異質(zhì)性突變1例。其中2例1555A＞G均質(zhì)性突變患兒為出生后用藥致聾，另1例異質(zhì)性突變患兒為先天性聾。

表2 58例耳聾基因突變NSHL患兒突變熱點分析（例）

3 討論

遺傳因素能夠影響耳聾的發(fā)生、發(fā)展，通過確定耳聾患者及高危人群的遺傳因素，給予正確的指導(dǎo)及干預(yù)措施，可一定程度上預(yù)防耳聾新發(fā)及加重。目前發(fā)現(xiàn)的耳聾基因眾多，突變譜廣泛，國內(nèi)NSHL患者耳聾基因熱點突變的確定為尋找國內(nèi)多數(shù)NSHL的病因指明了方向。

GJB2基因突變會導(dǎo)致耳蝸中的細胞縫隙連接中斷，導(dǎo)致聽覺功能失常。目前約有50%的常染色體隱性遺傳NSHL存在該基因耳聾突變[2]。GJB2基因突變導(dǎo)致的聽力損失多表現(xiàn)為先天性、雙側(cè)對稱性、非進行性重度或極重度耳聾。GJB2基因的突變幾乎覆蓋整個編碼區(qū)，其突變位點具有明顯的種族差異性，歐美人群中GJB2基因突變最多見為30delG或 35delG的熱點突變[3]，紀(jì)育斌等[4]2011年通過對國內(nèi)GJB2基因突變流行病學(xué)文獻的薈萃分析認(rèn)為國內(nèi)GJB2總體致病突變率為12.88%，總體突變率為19.41%。彭新等[5]報道揚州地區(qū)278例NSHL的GJB2基因突變率為31.7%，致病突變率為23.4%。張迪等[6]報道內(nèi)蒙古自治區(qū)355例NSHL患者GJB2基因突變率為14.93%；GJB2基因具有多種突變方式，國內(nèi)多項耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查研究表明，GJB2基因以235delC突變最常見，其次為 299delAT、176del 16，而35delG突變少見。戴樸等[7]對1 680例NSHL患者進行耳聾分子流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)GJB2 235delC突變率較高，為18.16%。于飛等[8]研究提示國內(nèi)不同地區(qū)NSHL患者235delC突變率為6.59%～25.18%。楊雪等[9]報道貴州省356例NSHL患者GJB2基因最常見突變位點是235delC。本研究結(jié)果顯示，寧波地區(qū)NSHL患兒GJB2基因致病突變率為13.01%（22/168），突變率為27.38%（46/168），表明寧波地區(qū)耳聾基因突變以GJB2突變最普遍；本研究結(jié)果顯示235delC突變率最高，為23.21%，突變率明顯高于GJB2其他位點，其中純合突變有22例，雜合突變有17例，說明235del也是寧波地區(qū)NSHL患兒中最常見的突變位點。

SLC26A4基因突變可引起NSHL及SHL。在NSHL中，SLC26A4基因與常見的一種內(nèi)耳畸形-大前庭導(dǎo)水管綜合征的發(fā)病有直接因果關(guān)系，國內(nèi)各地區(qū)有關(guān)SLC26A4基因突變率的報道并不一致：梁鵬飛等[10]報道陜西省 800例NSHL患者SLC26A4基因突變率為18.88%；劉水霞等[11]報道廣西地區(qū)127例NSHL患者SLC26A4基因突變率為2.36%；牟書瑜等[12]報道大連地區(qū)5 266例耳聾患者中SLC26A4基因突變率為9.72%。不同種族人群中SLC26A4基因突變譜不同，國內(nèi)SLC26A4基因突變熱點主要是IVS7-2A＞G：袁永一等[13]對國內(nèi)2 352例重度、極重度耳聾人群進行了SLC26A4基因全序列分析，發(fā)現(xiàn)IVS7-2A＞G位點突變率達到11.52%；何本超等[14]對湖北天門市52例聾啞兒童基因檢測發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因突變率為17.30%，以IVS7-2A＞G位點突變最為常見。本研究結(jié)果顯示SLC26A4基因熱點突變率為7.14%（12/168），其中純合突變3例，分別是1975G＞C、919A＞G和2168A＞G，此3例患兒臨床診斷均為大前庭導(dǎo)水管綜合征，其它熱點突變?yōu)殡s合突變，分別為1975G＞C、2168A＞G、1226G＞A和1229C＞T，并未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)報道最多的IVS 7-2 A＞G突變。除了選擇對象的不同，推測可能確實存在地區(qū)間的差異。受實驗條件限制，由于此基因的遺傳特性，雙等位基因突變可以導(dǎo)致耳聾表型的發(fā)生，對單雜合突變和復(fù)合雜合突變的耳聾患者，檢測結(jié)果受目前耳聾基因突變位點數(shù)目及種類的限制，不能檢出全部已知SLC26A4基因突變位點，所以SLC26A4基因單雜合突變患者應(yīng)進一步做基因測序明確病因。

線粒體12S rRNA基因突變跟母系遺傳有關(guān)，該突變攜帶者應(yīng)用氨基糖苷類藥物可造成不可逆的聽力損害。目前，mtDNA12S rRNA A1555G點突變導(dǎo)致的藥物性耳聾已成為公認(rèn)的突變致聾位點，紀(jì)育斌等[15]綜合16篇研究對象為NSHL患者的文獻數(shù)據(jù)，初步得出中國患者A1555G突變率為6.62%（230/3473）。本研究結(jié)果顯示12S rRNA突變率為1.79%（3/168），低于國內(nèi)其他報導(dǎo)，其中2例為1555 A＞G均質(zhì)性突變，此2例患兒均為出生后用藥致聾；另1例為異質(zhì)性突變，該患兒致聾病因與其有一定相關(guān)。目前在對這3個患兒母系家庭成員進行相關(guān)調(diào)查，擬行基因突變的篩查，找出攜帶該基因突變的氨基糖苷類藥物敏感聽力正常個體，通過科普宣教、指導(dǎo)用藥、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等干預(yù)措施，能阻斷該基因突變在此類家族中繼續(xù)傳遞。

總之，耳聾基因熱點突變篩查對于耳聾阻斷意義重大。對多數(shù)耳聾患者可以從分子學(xué)進行診斷，利用基因快速檢測技術(shù)篩查耳聾人群和突變基因攜帶者，通過產(chǎn)前診斷技術(shù)預(yù)防后代耳聾的發(fā)生。

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Screening of hot-spot deafness gene mutations among children with non-syndromic hearing loss in Ningbo region

GAO Weiwei,LU Wenxiang,ZHANG Lei,et al.Ningbo College of Health Sciences,Ningbo 315800,China

Hereditary hearing loss Non-syndromic hearing loss Hot-spot mutation Genetic diagnosis

2017-03-19）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2017-595

浙江省教育廳科研項目（Y201534685）

315100 寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院（高薇薇）；無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司研發(fā)部（盧文翔）；浙江大學(xué)明州醫(yī)院耳鼻咽喉科、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（張雷）；東南大學(xué)分子電子學(xué)國家重點實驗室（白云飛）

高薇薇，E-mail：wiwi_g@163.com

【 Abstract】 Objective To screen the hot-spot deafness gene mutation in children with non-syndromic hearing loss (NSHL)in Ningbo region. Methods One hundred and sixty eight NSHL children were enrolled from Ningbo Special Education Center for the study.The screening of 29 hot-spot mutations of 4 deafness genes was performed by multiple ARMS capillary electrophoresis using AGCU genetic deafness gene detection kit. Results Among 168 children,the deafness gene mutations were detected in 58 cases (34.52%),including 43 cases with single hotspot mutation in GJB2 gene,9 with hotspot mutations in single SLC26A4 gene,and 3 with GJB2 gene and SLC26A4 gene mutation,and 3 with 12S rRNA gene mutation.The total hot spot mutation rate of GJB2 gene was 27.38%,that of SLC26A4 gene was 7.14%,and that of 12S rRNA gene was 1.79%.The mutation rate of GJB2 235delC was the highest(23.21%),followed by GJB2 299 del AT(5.36%)in all hotspots. Conclusion GJB2 and SLC26A4 are the main genes associated with non-syndromic deafness patients in Ningbo area,and GJB2 235delC is the most common mutation site.