田海偉，馮浩彬，李 晉，李麗麗，李 揮，哈 婧,*

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定牛奶中18 種糖皮質(zhì)激素類藥物殘留

田海偉1,2，馮浩彬2，李 晉1，李麗麗1，李 揮2，哈 婧1,*

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

通過QuEChERS前處理方法，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式下的定性和定量分析，實(shí)現(xiàn)牛奶中18 種糖皮質(zhì)激素的同時(shí)檢測。牛奶樣品加入酸化乙腈溶劑提取后，加入氯化鈉和無水硫酸鎂進(jìn)行鹽析，經(jīng)PSA、C18吸附劑凈化后，取上清液進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。方法的基質(zhì)效應(yīng)影響在0.81～0.96之間，方法檢出限在0.1～0.3 μg/kg之間，定量限在0.3～1.1 μg/kg之間，在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，目標(biāo)物線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.993 6，3 個(gè)水平加標(biāo)回收率在73.7%～98.6%之間，精密度（n=5）在4.9%～12.9%之間。該方法簡單快捷、準(zhǔn)確可靠，適合于大批量牛奶樣品中糖皮質(zhì)激素的快速檢測。

牛奶；QuEChERS；糖皮質(zhì)激素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

糖皮質(zhì)激素又名“腎上腺皮質(zhì)激素”，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，主要為皮質(zhì)醇、多糖、脂肪和蛋白質(zhì)等，在生物合成和代謝過程中具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，還具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗毒、抗休克作用。在畜牧生產(chǎn)中，由于其對提高飼料轉(zhuǎn)化率有顯著作用進(jìn)而促進(jìn)禽畜和水生生物的生長繁殖而得到廣泛使用。然而近年來因?yàn)樯a(chǎn)者對其認(rèn)識不清、應(yīng)用原則掌握不嚴(yán)、市場監(jiān)管不力等原因使其在畜牧生產(chǎn)過程中出現(xiàn)濫用。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素類藥物在畜牧業(yè)中的過量使用導(dǎo)致的藥物殘留可引起肥胖、高血壓、骨質(zhì)疏松等疾病，危害消費(fèi)者健康[1-7]。

目前，針對獸藥殘留監(jiān)控的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范日益完善[8-10]。糖皮質(zhì)激素檢測手段主要有氣相色譜法[11-12]、高效液相色譜法[13-17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18]和液相色譜-質(zhì)譜法[19-23]。氣相色譜法和高效液相色譜法的靈敏度低，選擇性差。氣相色譜-質(zhì)譜法需要繁瑣的衍生過程。高效液相色譜-質(zhì)譜法因具有較高的靈敏度和特異性，已成為痕量藥物分析的首選方法。但高效液相色譜-質(zhì)譜法仍需要較好的凈化效率來減少基質(zhì)影響，以保證儀器的穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的前處理方法比較耗時(shí)費(fèi)力。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safety）法即為“快速、簡易、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定、安全”的萃取方法。自誕生以來己經(jīng)在農(nóng)藥殘留分析中得到了廣泛應(yīng)用。在國內(nèi)外研究者的探索過程中，將此方法應(yīng)用范圍擴(kuò)大到獸藥殘留、發(fā)光劑等方面。史文景等[24]建立同時(shí)檢測柑橘中4 種真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法。張耀海等[25]運(yùn)用QuEChERS前處理方法與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法得到軟包裝飲料中8 種光引發(fā)劑的測定方法。本實(shí)驗(yàn)建立牛奶中18 種激素類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。使用QuEChERS前處理方法進(jìn)行凈化提取，簡化實(shí)驗(yàn)前處理過程，提高實(shí)驗(yàn)效率。也可以為其他動物源性食品中的獸藥多殘留分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；N-丙基乙二胺（N-(n-propyl) ethylenediamine，PSA）（粒徑40～60 μm）、C18（粒徑50 μm）、NH2（粒徑40～60 μm）吸附劑 天津Agela Technologies公司；氯化鈉、無水硫酸鎂均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)所用水由美國Milli-Q超純水系統(tǒng)純化制得。

1.2 儀器與設(shè)備

20A高效液相色譜儀 日本島津公司；5500 QTrap四極桿/離子阱質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），應(yīng)用軟件Analyst（1.6版本）） 美國AB SCIEX公司；3K-15型離心機(jī) 美國Sigma公司；PT2100型均質(zhì)器 瑞士Kinematica公司；Milli-Q純化系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

取冷藏牛奶樣品放置室溫，稱取待測牛奶樣品5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 1%甲酸-乙腈溶劑渦旋提取2 min，加入1 g氯化鈉進(jìn)行鹽析，渦旋混合2 min，加入4 g無水硫酸鎂、50 mg PSA與75 mg C18吸附劑凈化后，以5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測定。

1.3.2 色譜條件

高效液相色譜分析柱為X B r i d g e B E H C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0.1～2 min，30% B；2～7.5 min，80% B；7.5～8.5 min，80% B；8.5～12 min，30% B。流速0.25 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reaction monitoring，MRM）模式；離子源溫度500 ℃；離子源電壓5 000 V；霧化氣壓力345 kPa；氣簾氣壓力241 kPa；輔助加熱氣壓力345 kPa；碰撞氣Medium且均為高純氮?dú)狻RM檢測離子對、去簇電壓及碰撞電壓見表1。

表1 18 種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜優(yōu)化條件Table1 Optimized mass spectrometric parameters for18 glucocorticoids

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

圖1 酸化乙腈對目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of concentration of acidified acetonitrile on recovery of the target analytes

由于糖皮質(zhì)激素的疏水性，實(shí)驗(yàn)選擇常用的提取溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙醚作為提取效果對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，乙腈、甲醇與牛奶中水互溶，儀器響應(yīng)表明乙腈提取效果比甲醇好；正己烷和乙醚不分層，提取液中雜質(zhì)較多，儀器響應(yīng)值不理想；乙酸乙酯不與水互溶，需要多次富集之后濃縮待用，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。所以實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑。

在乙腈中加入適量的酸有利于對牛奶樣品中蛋白質(zhì)的沉淀[26]，配制體積分?jǐn)?shù)0.5%、1%、2%、4%、6%的甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑。如圖1所示，1%甲酸-乙腈溶液提取效果最好，糖皮質(zhì)激素類藥物的回收率較高，實(shí)驗(yàn)過程中添加較多酸的乙腈溶液提取劑再進(jìn)一步凈化中易與凈化劑結(jié)合從而降低回收率。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖2 吸附劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of adsorbents on recovery of the target analytes

常用的吸附劑有PSA、C18、石墨化碳等[27-31]。牛奶中富含脂肪、糖類和蛋白質(zhì)等成分，根據(jù)牛奶的基質(zhì)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選取了PSA、C18、NH23 種吸附劑作為實(shí)驗(yàn)考察對象，如圖2所示，經(jīng)過NH2吸附劑凈化的樣品復(fù)溶過膜后仍呈現(xiàn)混濁狀態(tài)，很容易對儀器造成污染，C18凈化后基質(zhì)效應(yīng)降低，且回收率都在80%左右，PSA進(jìn)行凈化后基質(zhì)效應(yīng)也有明顯改觀，實(shí)驗(yàn)將PSA、C182 種吸附劑同時(shí)運(yùn)用到前處理發(fā)現(xiàn)，50 mg PSA與75 mg C18吸附劑的組合時(shí)基質(zhì)干擾小，且目標(biāo)化合物的回收率更接近100%，過多的吸附劑可以吸附目標(biāo)化合物使回收率降低。

2.3 液相色譜條件的優(yōu)化

18 種糖皮質(zhì)激素中有2 對同分異構(gòu)體，分別為潑尼松龍和可的松、地塞米松和倍他米松，因精確分子質(zhì)量均相同，若要準(zhǔn)確定量這些化合物，色譜峰要有一定程度的分離。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸溶液、0.2%甲酸溶液作為流動相，運(yùn)用不同的梯度，在XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）色譜柱上進(jìn)行色譜分離，結(jié)果運(yùn)用甲醇不能夠分開地塞米松和倍他米松，0.1%甲酸溶液的響應(yīng)要稍高于0.2%甲酸溶液。因此，方法選擇0.1%甲酸和乙腈為流動相。優(yōu)化液相色譜條件測定樣品如圖3所示。

圖3 牛奶中18 種糖皮質(zhì)激素的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of18 glucocorticoids in milk

2.4 質(zhì)譜條件的確立

糖皮質(zhì)激素在質(zhì)譜的行為較為復(fù)雜，在ESI－可產(chǎn)生[M－H]－、[M+CH3COO]－和[M+HCOO]－的負(fù)離子，在ESI+可產(chǎn)生[M+H]+的正離子。在負(fù)離子掃描模式下，若流動相含有甲酸或甲酸銨則以[M+HCOO]－為主，若含有乙酸根則以[M+CH3COO]－為主，若兩者都沒有則以[M－H]－為主，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)負(fù)離子掃描模式穩(wěn)定較[M+H]+差。所以方法采用正離子掃描模式。本研究對每種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，使實(shí)驗(yàn)的定量分析更加穩(wěn)定有效。首先將每種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL），使用針泵流動注射直接進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定其母離子和子離子，為了使每種目標(biāo)物質(zhì)的靈敏度達(dá)到最佳，在針泵進(jìn)樣過程中需要優(yōu)化碎裂電壓、碰撞電壓等儀器參數(shù)。每種分析物要選擇最強(qiáng)且穩(wěn)定的離子作為定量離子，另一個(gè)則為定量離子。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1 特異性

方法采用MRM模式，提取偏差在±0.005‰范圍內(nèi)的精確質(zhì)荷比的色譜圖進(jìn)行定量，加上色譜保留時(shí)間，方法的特異性高，沒有發(fā)現(xiàn)有干擾成分影響18 種糖皮質(zhì)激素的測定。在空白樣品和空白樣品添加的色譜質(zhì)譜圖中未發(fā)現(xiàn)干擾峰，說明方法具有較好的選擇性。

2.5.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限和定量限結(jié)果

表2 方法的線性、基質(zhì)效應(yīng)、LOD 和 LOQTable2 Linearity, matrix effect, LOD and LOQ of the method

對前處理凈化方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)，如表2所示，其中倍氯米松、氟米龍的基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng)，為0.96，其余均在0.81到0.96之間。從回收率和精密度結(jié)果來看，雖然18 種糖皮質(zhì)激素均有一定的基質(zhì)效應(yīng)影響，但并不影響測定的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)[32-34]研究基質(zhì)效應(yīng)在0.80～1.20之間可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。

用18 種糖皮質(zhì)激素的混合定溶液配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用分析物峰面積與被測組分的質(zhì)量濃度作圖，方法在0.5～100 ng/mL呈線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)（R2）高于0.993 6。以3 倍和10 倍信噪比確定了方法的檢出限和定量限，18 種分析物的定量限在0.3～1.1 μg/kg之間。

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

在3 個(gè)水平做了添加回收率實(shí)驗(yàn)，考察了方法的準(zhǔn)確度和精密度，如表3所示，回收率在73.7%～98.6%之間，精密度在4.9%～12.9%之間。方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 方法的回收率和精密度（ = 5）Table3 Recovery and precision of the method ( = 5)

2.6 牛奶樣品中18 種糖皮質(zhì)激素的測定結(jié)果

圖4 殘留氫化可的松的牛奶樣品Fig.4 Detection of the presence of hydrocortisone residues in one milk sample

用實(shí)驗(yàn)建立方法檢測12 種不同品牌的市售牛奶，如圖4所示，在其中1 種牛奶中含有微量的氫化可的松，其余批次的牛奶未發(fā)現(xiàn)其他種類的獸藥殘留。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化對比實(shí)驗(yàn)，探討提取凈化等QuEChERS前處理?xiàng)l件，考察牛奶樣品的基質(zhì)效應(yīng)，優(yōu)化QuEChERS前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜條件，研究方法的回收率、檢出限和定量限等技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中18 種糖皮質(zhì)激素的同時(shí)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡單快捷、準(zhǔn)確可靠，適合于市售牛奶樣品中糖皮質(zhì)激素的快速檢測。

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Rapid Determination of18 Glucocorticoids in Milk Using QuEChERS Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TIAN Haiwei1,2, FENG Haobin2, LI Jin1, LI Lili1, LI Hui2, HA Jing1,*
(1. College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Hebei Food Safety Key Laboratory, Shijiazhuang 050200, China)

A simple, rapid and sensitive method for the simultaneous determination of18 kinds of glucocorticoids in milk was developed by the quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) method coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Milk samples were extracted with acidified acetonitrile, and salted out by adding sodium chloride anhydrous sodium magnesium sulfate. After purification with PSA and C18as the adsorbent, the supernatant was analyzed by HPLC-MS/MS. The matrix effect in the method was in the range of 0.81-0.96, the limits of detection (LODs) were in the range of 0.1-0.3 μg/kg and the limits of quantification (LOQs) for the analytes were in range of 0.3-1.1 μg/kg. The method exhibited a good linear relationship in the range of 0.5-100 ng/mL, with a correlation coefficient (R2) of higher than 0.993 6, and recoveries were between 73.7% and 98.6% at three spiked levels with relative standard deviations (n = 5) of 4.9%-12.9%. This method was simple, accurate, reliable, and suitable for the rapid detection of glucocorticoids in bulk serum samples.

milk; QuEChERS; glucocorticoids; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLCMS/MS)

10.7506/spkx1002-6630-201712048

O656

A

1002-6630（2017）12-0310-05

田海偉, 馮浩彬, 李晉, 等. QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定牛奶中18 種糖皮質(zhì)激素類藥物殘留[J].食品科學(xué), 2017, 38(12)： 310-314.

10.7506/spkx1002-6630-201712048. http：//www.spkx.net.cn

TIAN Haiwei, FENG Haobin, LI Jin, et al. Rapid determination of18 glucocorticoids in milk using QuEChERS coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 310-314. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712048. http：//www.spkx.net.cn

2016-12-07

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（15275505D）；北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（BKBD-2016KF（01））

田海偉（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锒鄽埩舴治?。E-mail：15511371395@163.com

*通信作者：哈婧（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：hajing02@163.com