段慶梓，尚柯，張彪，張玉，王巍，梁恒興

（成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610045）

肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鑒別

段慶梓，尚柯，張彪，張玉，王巍，梁恒興*

（成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610045）

通過牦牛與其他常見物種的細胞色素b基因序列進行比對，設(shè)計牦牛的特異性引物，并進行聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）體系中不同條件、參數(shù)的考察，建立肉及肉制品中牦牛源性檢測的PCR方法。該方法具有較好的專屬性，建立的PCR體系僅對牦牛源性有擴增現(xiàn)象，而對其他物種無擴增，且對牦牛源性的檢出限可達到1%。能夠滿足檢驗機構(gòu)或生產(chǎn)企業(yè)對肉及肉制品中牦牛源性的檢測需求。

肉制品；牦牛；聚合酶鏈式反應(yīng)；分子鑒別

牦牛（Bog grunniens）是唯一能適應(yīng)青藏高原及周邊地區(qū)特殊生態(tài)環(huán)境且延續(xù)至今的牛種，主要分布于我國的青藏高原地區(qū)，為廣大藏區(qū)人民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生產(chǎn)、生活必需品，具有不可替代性，也是該區(qū)域草地畜牧業(yè)和民族經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的資源依托[1]。

牦牛肉作為一種高品質(zhì)肉類，氨基酸含量豐富、種類齊全，營養(yǎng)成分顯著高于其他牛種[2]。近年來，隨著旅游行業(yè)的快速發(fā)展，牦牛肉制品以其較好的營養(yǎng)價值和獨特的天然口感越來越受到消費者的青睞，但其市場價格與其他牛肉存在較大差異。有報道曝光不良商家用黃牛肉、水牛肉甚至豬肉等肉質(zhì)來冒充牦牛肉的情況，以次充好，謀取暴利，欺騙消費者。因此，牦牛肉制品中牦牛成分的鑒別已成為亟需解決的問題。

目前有研究通過對線粒體12sRNA進行基因擴增、序列比對和限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性反應(yīng)來對黃牛、水牛、牦牛等物種進行鑒別[3-4]，雖然這些方法能夠?qū)﹃笈Ｔ葱赃M行鑒別，但其操作過程復雜、結(jié)果判定的專屬性不強，未能形成對牦牛源性快速、準確的鑒別。動物線粒體脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）作為高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，與核基因組相比具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速率快、多態(tài)性豐富、無重組和遵循母系遺傳等特點，是一個比較理想的用于檢測的靶基因，并且在動物所有組織細胞中均含有大量線粒體，因此可以獲得大量的線粒體DNA[5-6]。早在20世紀90年代就有學者用細胞色素b（Cytochrome b，Cytb）基因作為分子標記來進行肉源性的鑒別，即使在各種條件下處理過的肉制品，也能通過Cytb基因的PCR擴增和序列比對的方法來進行鑒別[7-9]。

在本研究中，通過牦牛與其他常見物種Cytb基因的序列比對，設(shè)計牦牛特異性引物，并對PCR體系中不同條件、參數(shù)的考察，最終建立了牦牛源性檢測的PCR方法。目的在于突破現(xiàn)有牦牛源性檢測的局限性，在遺傳本質(zhì)上為牦牛源性提供一種快速、準確、專屬性強的鑒別方法。

1 材料

1.1 樣品與對照

生鮮牦牛肉：四川阿壩州馬爾康市農(nóng)貿(mào)市場；牦牛肉制品：西藏、青海、四川當?shù)爻胸浖埽魂栃詫φ眨ㄉr牦牛肉）：四川省阿壩州馬爾康市場；陰性對照為常見的動物肉樣（黃牛、水牛、豬、綿羊、兔、雞、鴨、馬、小鼠、貓、狐貍、貉）：中國檢驗檢疫科學研究院；空白對照為滅菌的超純水。

1.2 試劑

動物基因組提取試劑盒（GK0122）：上海捷瑞生物科技有限公司；2×PCR預(yù)混液（K20420）：北京Transgene公司；DNA Marker：北京天根生物科技有限公司；GoldView：北京百泰克公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

LS-P96GPCR儀：美國FisherScientific公司；5427R離心機：德國Eppendorf公司；PowerPac Basic電泳儀：美國BIO-RAD公司；GelDoc凝膠成像儀：美國UVP公司；ME2002E電子天平：瑞士特勒-托利多公司；P-330核酸蛋白儀：德國IMPLEN公司；DK-420水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GENIE 2渦旋儀：美國IKA公司。

2 方法

2.1 特異性引物的設(shè)計

研究選取線粒體DNA中的Cytb基因作為目標檢測的靶基因，在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找不同品種牦牛及常見動物（黃牛、水牛、豬、綿羊、兔、雞、鴨、馬、小鼠、貓、狐貍、貉）的Cytb基因序列，并進行物種間的序列比對，在牦牛與其他物種的DNA堿基差異區(qū)域設(shè)計牦牛特異性引物（見圖1），用于牦牛的特異性檢測；所設(shè)計引物由上海生工進行合成，具體引物堿基序列見表1。

圖1 牦牛源性特異性引物位置Fig.1Specific primers for identification of yak

表1 牦牛源性鑒別引物序列Table 1Primer sequence for identification of yak

2.2 樣品前處理及DNA提取

對不同種類的牦牛肉制品取樣前須去除附著的調(diào)料及油脂，選取8個不同的瘦肉部位進行取樣，加入液氮，研磨成肉糜樣，備用。在前處理過程中須使用滅菌的器具進行操作，避免各批次樣品之間的交叉污染。

稱取前處理后的樣品30 mg～50 mg，按試劑盒說明進行DNA提取，最終溶于50 μL滅菌的超純水中，-20℃保存?zhèn)溆?。并對提取的DNA進行A260/A280值測定，測定的A260/A280比值在1.8～2.0之間，DNA濃度在100 ng/μL～150 ng/μL。

2.3 牦牛特異性引物退火溫度的考察

為確定牦牛特異性引物YAK-P和YAK-RP的最佳退火溫度，進行了溫度梯度的篩選，分別設(shè)置退火溫度為：56、58、60、62、64℃。PCR擴增均設(shè)置為30個循環(huán)反應(yīng)。

2.4 不同比例混合肉樣的PCR檢測

為確定牦牛源性鑒別PCR方法的靈敏度，研究設(shè)計了牦牛肉分別與豬肉、水牛肉和黃牛肉不同比例混合的肉樣進行PCR檢測。即分別以豬肉、水牛肉和黃牛肉為基質(zhì)，相應(yīng)添加1%、5%、10%、25%、50%的牦牛肉進行制樣，充分混合均勻后進行DNA提取，以混合樣DNA為模板進行牦牛鑒別引物的PCR擴增。

2.5 牦牛源性PCR檢測體系的方法學驗證

Cytb基因在牦牛種內(nèi)具有高保守的特點，該特異性檢測可以對牦牛種內(nèi)所有品系進行鑒定。由于不同地區(qū)牦牛的基因組中存在多態(tài)性位點[10]，為避免牦牛多態(tài)性位點存在于特異性引物的3'端，造成引物無法有效擴增的現(xiàn)象，利用牦牛特異性引物與NCBI數(shù)據(jù)庫中提交的牦牛品種Cytb基因進行比對（見圖2），結(jié)果顯示牦牛特異性引物（YAK-P，YAK-RP）的3'端均位于牦牛序列的保守區(qū)，理論上證明了所設(shè)計的牦牛鑒別特異性引物能夠?qū)λ嘘笈Ｆ贩N實現(xiàn)PCR擴增。

圖2 牦牛特異性引物與不同品種牦牛Cytb序列比對Fig.2Specific primersof yak alignment with different strains of yak

本研究分別從西藏、青海、四川購買牦牛肉制品共計9個批次，進一步對所設(shè)計的牦牛特異性引物及PCR檢測體系進行適應(yīng)性考察。

2.6 結(jié)果分析

對所有PCR結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳，配制膠濃度為1.5%，并加入核酸染料GoldView。電泳條件為120 V恒壓電泳至凝膠中部，保存凝膠圖譜以進行結(jié)果判定。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)不同的退火溫度分別對牦牛特異性引物進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同退火溫度的PCR反應(yīng)Fig.3PCR results of different annealing temperature

56℃～64℃均有牦牛源性的PCR擴增，退火溫度為64℃時，擴增條帶與其他溫度相比較弱，而56℃～ 62℃的擴增條帶亮度較為一致，依據(jù)退火溫度越高，引物結(jié)合的特異性越好的原則，選擇62℃為最佳的退火溫度。

依據(jù)篩選的最佳退火溫度，設(shè)定PCR反應(yīng)程序為：94℃5 min，30個循環(huán)（94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。反應(yīng)體系的體積為25 μL：2×PCR混合液12.5 μL、正反向引物（20 μmol/L）各0.4 μL、模板DNA 1 μL，滅菌超純水補足25 μL。

3.2 牦牛源性試驗對照的PCR結(jié)果

分別對牦牛陽性、陰性和空白對照進行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 牦牛特異性引物對陽性對照、陰性對照和空白對照的PCR結(jié)果Fig.4PCR results of positive control，negative control and blank control

除牦牛能夠擴增出301 bp的單一條帶，其他物種均無條帶擴增，以此來實現(xiàn)牦牛與其他物種的鑒別。該結(jié)果表明所設(shè)計的特異性引物及建立牦牛源性PCR檢測體系的能夠?qū)﹃笈Ｔ葱赃M行準確鑒別，專屬性較好。

3.3 不同比例混合肉樣的PCR結(jié)果

不同比例混合肉樣的PCR結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同比例混合肉樣的PCR擴增Fig.5PCR results of different proportions with yak，pig，cattle and buffalo

在豬肉、黃牛肉和水牛肉中添加1%的牦牛肉時即被檢出，PCR條帶較弱，但隨著牦牛肉比例的增加，PCR條帶的亮度也逐漸變量，與添加量的變化基本呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，所建立的牦牛鑒別PCR體系所能檢出牦牛源性的檢出限為1%，反應(yīng)體系的靈敏度較高。

3.4 牦牛源性PCR檢測體系適應(yīng)性的考察

分別取從不同產(chǎn)區(qū)購買的9批牦牛肉制品進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同產(chǎn)區(qū)樣品牦牛源性PCR結(jié)果Fig.6PCR results of yak samples from different regions

所購買的9批牦牛肉制品均出現(xiàn)與牦牛陽性對照一致的條帶；表明所有樣品都含有牦牛源性成分。該結(jié)果表明所建立的牦牛特異性PCR鑒別體系對市場售賣的牦牛肉制品有較好的方法適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本研究依據(jù)牦牛與其他常見物種Cytb基因的堿基差異，設(shè)計了特異性引物，并建立了牦牛源性檢測的PCR反應(yīng)體系，該體系能夠?qū)﹃笈U增大小為301 bp的條帶，而對其他物種無擴增，因此得以鑒別。通過進行牦牛與豬肉、水牛和黃牛不同比例混合肉樣的方法研究，該體系對牦牛源性的檢測低限可達到1%。同時，建立的牦牛特異性PCR鑒別體系對市售的牦牛肉制品有較好的方法適應(yīng)性。

綜上所述，本研究建立的肉及肉制品中牦牛源性成分檢測的PCR體系，能夠完成對不同牦牛肉制品的特異性檢測，且方法準確、快速，操作簡便，適合作為檢驗機構(gòu)或生產(chǎn)企業(yè)用于牦牛源性成分的檢測方法。

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PCR Identification of Yak in Meat and Meat Products

DUAN Qing-zi，SHANG Ke，ZHANG Biao，ZHANG Yu，WANG Wei，LIANG Heng-xing*
（Chengdu Institute of Food and Drug Control，Chengdu 610045，Sichuan，China）

The specific primer of yak was designed by cytochrome b gene alignment between yak and other common species，which was used to establish the PCR detection of yak in meat products by Investigation of different conditions and parameters.The established PCR system had better specificity，which could only have amplification of yak，and not amplification of other species.The detection limit of yak could reach to 1%.The yak PCR system established could meet the demand of institutions or production enterprises to detect the source of yak in meat and meat products.

meat product；yak；polymerase chain reaction；molecular identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.035

2017-02-17

成都市科技惠民應(yīng)用示范項目（2015-HM02-000990SF）

段慶梓（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品藥品的分子鑒別。

*通信作者：梁恒興（1978—），男（漢），副研究員，研究方向：食品藥品檢驗檢測。