王欣麗++陳亮

[摘要] 目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T基因多態(tài)性與老年冠心病心衰的關(guān)系。 方法 選擇2014年10月～2015年11月在濰坊市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）保健科、心內(nèi)科住院診斷為冠心病心衰的患者66例作為心衰組，45例住院診斷為冠心病穩(wěn)定型心絞痛患者作為冠心病組，同時(shí)選擇我院同期健康體檢者40名作為健康組。所有入選對(duì)象利用直接基因測(cè)序方法檢測(cè)MTHFR C677T基因多態(tài)性，并采用高效液相色譜法測(cè)定血漿同型半胱氨酸水平。 結(jié)果 心衰組TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于冠心病組和健康組，冠心病組高于健康組（P < 0.05）；與CC型比較，CT型及TT型者患心衰的風(fēng)險(xiǎn)增加（P < 0.05）。 結(jié)論 MTHFR C677T C→T突變后，TT基因型及T等位基因可能是冠心病心衰發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞] MTHFR C677T基因多態(tài)性；老年；冠心??；心力衰竭

[中圖分類(lèi)號(hào)] R541.61 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（b）-0012-05

Study on association between MTHFR C677T gene polymorphism and coronary heart diseases complicated with heart failure in the elderly patients

WANG Xinli1 CHEN Liang2

1.Clinical Medical College， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261041， China； 2.Health Center， Weifang Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital， Shandong Province， Weifang 261041， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between MTHFR C677T gene polymorphism and heart failure in the elderly patients. Methods Sixty-six patients diagnosed as coronary heart diseases （CHD） complicated with heart failure hospitalized in Department of Health and Department of Cardiology of Weifang People's Hospital （“our hospital” for short） from October 2014 to November 2015 to were selected as heart failure group， 45 cases diagnosed as stable angina pectoris of CHD were selected as CHD group， and 40 healthy persons with physical examination in our hospital at the same time were selected as healthy group. MTHFR C677T polymorphism was detected by PCR-direct sequencing method. Plasma total homocysteine was measured using high-performance liquid chromatography （HPLC） with fluorescence detection. Results The frequencies of genotype TT and allele T of C677T of MTHFR gene in the heart failure group were significantly higher than those of CHD group and healthy group， which of CHD group were higher than those of healthy group （P < 0.05）. Compared with homozygote CC， homozygote TT and heterozygote CT increased the risk of heart failure in the elderly patients （P < 0.05）. Conclusion After mutation of MTHFR C677T C→T， genotype TT and allele T may be the risk factors of CHD complicated with heart failure.

[Key words] MTHFR C677T gene polymorphism； Elderly； Coronary heart diseases； Heart failure

心力衰竭是各種心血管疾病的終末階段，是心功能不全的一組病理生理綜合征。隨著老齡化社會(huì)程度的加重，我國(guó)心力衰竭的發(fā)病率和患病率逐年上升，醫(yī)療支出比重大。臨床和流行病學(xué)資料[1-2]證實(shí)同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈病變、高血壓病以及外周血管病變等發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy水平有關(guān)。賈如意等[3]研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者中血漿Hcy水平增加，而MTHFR C677T C→T突變后，造成高同型半胱氨酸血癥。推測(cè)MTHFR C677T T等位基因的頻率可能是一種新的導(dǎo)致心力衰竭的危險(xiǎn)因素。目前關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性與心力衰竭的研究尚少。本研究探討老年心力衰竭患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性分布及與冠心病心衰的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年10月～2015年11月濰坊市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）保健科、心內(nèi)科診斷為冠心病心衰的住院患者66例作為心衰組，45例冠心病無(wú)心衰的穩(wěn)定型心絞痛患者作為冠心病組，選擇我院同期40名健康體檢老年人作為健康組。所有冠心病患者既往或住院期間行冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心病，并符合冠心病最新指南標(biāo)準(zhǔn)[4]。心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)按照Framingham標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：近4周之內(nèi)患急性心肌梗死的患者；不穩(wěn)定型心絞痛患者；心包疾病、心肌病及心肌炎、風(fēng)濕性瓣膜病、先天性心臟病，以及高血壓病、肺心病等引起的心力衰竭；嚴(yán)重惡性心律失常；嚴(yán)重肝、腎功能不全，血液、免疫、甲狀腺疾病，嚴(yán)重感染及腫瘤等疾??；所有觀察對(duì)象均自愿參加，均知情并簽署同意書(shū)。本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)專(zhuān)家討論通過(guò)。

1.2 資料收集

收集研究對(duì)象的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、吸煙史和高血壓病史等。

1.3 標(biāo)本處理

1.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 所有觀察者空腹抽取外周靜脈血10 mL，5 mL用于測(cè)定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、空腹血糖（FBG）等。余5 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的試管中，采用高效液相色譜分析法檢測(cè)Hcy。

1.3.2 DNA提取前準(zhǔn)備 抽取5 mL外周靜脈血置于EDTA抗凝劑的試管中，于-70℃冰箱保存，用于提取DNA。

1.4 MTHFR基因C677T多態(tài)性的測(cè)定

1.4.1 DNA提取 取所有觀察者的冷凍EDTA抗凝外周血，于37℃水浴迅速融化，采用全血基因組DNA快速提取試劑盒（天根生物）提取基因組DNA。

1.4.2 PCR基因擴(kuò)增 根據(jù)MTHFR基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為：上游引物F：TGCCCAGTCCCTGTGGTCTCT，下游引物R：GCCTTCACAAAGCGGAAGAAT，由北京尤比愛(ài)生工合成。從大連寶生物公司購(gòu)買(mǎi)熱啟動(dòng)DNA聚合酶。擴(kuò)增條件：94℃解鏈5 min×1個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min 1個(gè)循環(huán)。

1.4.3 基因測(cè)序 將PCR產(chǎn)物各取30 μL送尤比愛(ài)生物工程（北京）股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間連續(xù)變量采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，OR及95%CI表示患病風(fēng)險(xiǎn)，計(jì)算各組基因型頻率及等位基因頻率，以Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)基因分布，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組臨床基線資料比較

三組性別比、年齡、身高、體重、高血壓病史、TG、和肌酐（Scr）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。三組吸煙史、FBG、TC和Hcy比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 基因測(cè)序結(jié)果

各組血液樣本DNA提取擴(kuò)增后，經(jīng)直接測(cè)序得出TT、CT和CC基因型圖譜，具體見(jiàn)圖1。

2.3 MTHFR C677T基因多態(tài)性分布與冠心病心衰的關(guān)系

健康組、冠心病組和心衰組人群經(jīng)χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（健康組：χ2=4.15，P > 0.05；冠心病組：χ2=3.44，P > 0.05；心衰組：χ2=0.072，P > 0.05），說(shuō)明研究樣本具有群體代表性。心衰組和冠心病組T等位基因的頻率與TT基因型頻率分別為59%、34.8%和55%、37.8%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.403，P = 0.002<0.05）。三組T等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.367，P = 0.000<0.05）。見(jiàn)表2。設(shè)定CC基因型者患冠心病心衰的風(fēng)險(xiǎn)為對(duì)照（設(shè)數(shù)值為1.000），心衰組與CC基因型攜帶者比較，攜帶CT（OR = 4.699，95%CI：1.775～12.440，P = 0.01）或TT（OR = 7.318，95%CI：2.300～23.282，P = 0.00）基因型的患者其發(fā)生心衰的危險(xiǎn)性更大。

表2 MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布表

2.4 不同基因型間Hcy比較

所有觀察對(duì)象按基因型進(jìn)行分組，TT基因型組46例，Hcy平均水平為（21.34±2.72） μmol/L；CT基因型組61例，Hcy平均水平為（15.51±2.57） μmol/L，CC基因型組41例，Hcy平均水平為（11.26±2.43） μmol/L，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 13.535，P = 0.000<0.05）。

3 討論

2015年的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)心衰患者高達(dá)400萬(wàn)例，成年人心衰的患病率為0.9%[6]。我國(guó)心力衰竭的主要原因是冠心病。Boushey等[7]對(duì)4000多例患者的研究發(fā)現(xiàn)，Hcy濃度每升高5 μmol/L時(shí)，男性發(fā)生冠心病的概率升高1.6倍，女性發(fā)生冠心病的概率升高1.8倍。高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHcy）是慢性心力衰竭的危險(xiǎn)因素。陳平安等[8]發(fā)現(xiàn)Hcy隨著心功能的惡化而增高，并能反映心衰的嚴(yán)重程度。Veeranna等[9]發(fā)現(xiàn)Hcy可導(dǎo)致冠心病患者發(fā)生心衰的概率倍增。李秀昌等[10]發(fā)現(xiàn)Hcy水平與左室心肌質(zhì)量、左室質(zhì)量指數(shù)及舒張末期室間隔厚度呈明顯正相關(guān)，并證實(shí)HHcy血癥是影響心血管結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。HHcy主要是由遺傳因素、環(huán)境因素和營(yíng)養(yǎng)因素改變導(dǎo)致。MTHFR C677T位基因突變是導(dǎo)致HHcy最主要的遺傳原因。當(dāng)基因發(fā)生突變時(shí)，MTHFR酶活性改變，導(dǎo)致Hcy向蛋氨酸轉(zhuǎn)化受阻及DNA低甲基化，Hcy在體內(nèi)蓄積，形成HHcy血癥。而HHcy與心力衰竭關(guān)系密切，推測(cè)MTHFR C677T突變可能與心力衰竭有關(guān)。本研究結(jié)果提示，按MTHFR基因型分組后，TT基因型組和CT基因型組血漿Hcy都明顯高于CC基因型人群組，說(shuō)明TT純合突變型或T等位基因頻率高時(shí)，血漿Hcy水平顯著升高。

MTHFR基因位于染色體1p36.3，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，有20多種突變位點(diǎn)，其中以C677T位點(diǎn)最為常見(jiàn)。MTHFR C677T突變位是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，為不完全顯性遺傳[11]。MTHFR基因多態(tài)性與心血管疾病密切相關(guān)[12]，其中與冠心病[13]、H型高血壓[14]的研究頗多。Hamelahti等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TT純合突變型時(shí)動(dòng)脈內(nèi)中膜斑塊及厚度增加的發(fā)生率是最高的。靳鈺等[16]認(rèn)為MTHFR C677T基因多態(tài)性與高血壓病患者發(fā)生冠心病有關(guān)。Yi等[17]發(fā)現(xiàn)通過(guò)補(bǔ)充葉酸降低血漿Hcy，可以有效改善冠狀動(dòng)脈疾病患者血管舒張功能。也有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T多態(tài)性可能與代謝綜合征的發(fā)生有關(guān)[18]。王晟等[19]發(fā)現(xiàn)Mir-499b通過(guò)增強(qiáng)MTHFR的表達(dá)降低血清Hcy的表達(dá)量減少老年慢性心力衰竭的發(fā)病率。以上研究結(jié)果表明，MTHFR C677T突變與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病和冠心病相關(guān)，也有研究不支持此結(jié)論[20]。本研究中，心衰組TT基因型頻率及T等位基因頻率分別為59%、34.8%，明顯高于冠心病組和健康組，推測(cè)TT基因型或T等位基因的頻率與老年冠心病心衰有關(guān)。心衰組中CT基因型與TT基因型誘發(fā)心衰發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為4.699和7.318，認(rèn)為MTHFR C677T位突變TT基因型或CT基因型是誘發(fā)心衰的危險(xiǎn)因素，與CC基因型比較，其發(fā)生心衰風(fēng)險(xiǎn)增加，可見(jiàn)MTHFR 677T基因TT基因型及T等位基因是心力衰竭的危險(xiǎn)因素。MTHFR基因C677T突變可能與心衰遺傳易感性有關(guān)。

綜上所述，MTHFR基因C677T多態(tài)性是冠心病心衰的危險(xiǎn)因素。在冠心病心衰患者中進(jìn)行Hcy水平檢測(cè)和MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測(cè)，為早期預(yù)防心血管疾病和發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)人群提供新思路，為冠心病心衰的治療提供新領(lǐng)域。然而，本研究入選的樣本量有限，未對(duì)研究對(duì)象的種族、地域及研究方法等方面加以權(quán)衡，因而所得的結(jié)論需要更多的大樣本臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳磊，常榮.亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2016，8（1）：113-114.

[2] 陳梅玲，林小慧，李清華，等.動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者血漿同型半胱氨酸水平及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18（9）：733-736.

[3] 賈如意，趙潔，柳翠霞，等.老年冠心病慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸的變化[J].心臟雜志，2010，1（2）：228-230.

[4] 張永珍，高煒.穩(wěn)定性冠心病診治策略的選擇：歐美指南給我們的提示[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，46（6）：832-835.

[5] 陳鑫，解玉水，殷兆芳，等.住院冠心病心力衰竭患者的預(yù)后相關(guān)因素分析[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2016，25（3）：247-250.

[6] 周京敏，崔曉通，葛均波，等.中國(guó)心力衰竭的流行病學(xué)概況[J].中華心血管病雜志，2015，43（12）：1018-1021.

[7] Boushey CJ，Beresford SA，Omenn GS，et al. Aquantitative assessment of plasma homocysteineasa risk factor forvascular disease.Probable benefits of increasing folicacid intakes [J]. JAMA，1995，274（13）：1049-1057.

[8] 陳平安，李韶南，雷曉明，等.同型半胱氨酸水平與慢性心力衰竭嚴(yán)重程度及短期預(yù)后的關(guān)系[J].臨床心血管病雜志，2013，12（12）：931-933.

[9] Veeranna V，Zalawadiya SK，Niraj A，et al. Homocysteine and reclassification of cardiovascular disease risk [J]. J Am Coll Cardiol，2011，58（10）：1025-1033.

[10] 李秀昌，胡燕燕，張運(yùn)，等.應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)同型半胱氨酸水平與心血管結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系[J].中華超聲影像學(xué)雜志，2000，9（9）：524.

[11] 肖燕，單可人，李毅，等.貴州三個(gè)民族亞甲基四氫葉酸還原酶基因的遺傳多態(tài)性[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005， 22（2）：219-221.

[12] 王紅，張向陽(yáng).亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性對(duì)心血管疾病的影響[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（4）：450-453.

[13] 張良峰，王新，李海燕，等.N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸與冠心病的關(guān)系[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2016，24（10）：1023-1026.

[14] 王佳，王淑玲，曾丹，等.亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性與H型高血壓及同型半胱氨酸水平升高的相關(guān)性研究[J].中國(guó)腦血管病雜志，2015，12（11）：581-586.

[15] Hamelahti P，Jarvinen O，Sisto T，et al. Methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T mutation is related to the defects in the internal elastic lamina of the artery wall [J]. Eur J Clin Invest，2002，32（12）：869-873.

[16] 靳鈺，趙連友，侯允天，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓患者合并冠心病的相關(guān)性研究[J].中華老年心血管雜志，2011，13（12）：1081-1083.

[17] Yi X，Zhou Y，Jiang D，et al. Efficacy of folic acid supplementation onendothelial function and plasma homocysteine concentration in coronary artery disease：a meta-analysis of randomized controlled trials [J]. Exp Ther Med，2014，7（5）：1100-1110.

[18] Yang B，F(xiàn)an S，Zhi X，et al. Associations of MTHFR C677T and MTHFR A66G gene polymorphisms with metabolic syndrome：a case-control study in Northern China [J]. Int J Mol Sci，2014，15（12）：21687-21702.

[19] 王晟，龍靜，胡金牛，等. MicroRNA-499b通過(guò)亞甲基四氫葉酸還原酶調(diào)節(jié)老年慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸水平的機(jī)制及意義[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2016， 36（12）：2860-2862.

[20] 吳曉芬，程龍獻(xiàn)，何美安，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)性研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，38（12）：296-300.

（收稿日期：2016-09-05 本文編輯：張瑜杰）