萬玉林 陶世宇 武發(fā)菊 柴立麗 安芳蘭 楊進才 劉學(xué)榮

摘要綜述了MDCK細胞的來源、生物學(xué)特性及培養(yǎng)方式，旨在為今后MDCK細胞的培養(yǎng)及流感病毒細胞介質(zhì)疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

關(guān)鍵詞MDCK細胞；生物學(xué)特性；無血清培養(yǎng)基；微載體；懸浮培養(yǎng)

中圖分類號S859.79文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）23-0096-03

Research Progress on MDCK Cells

WAN Yulin，TAO Shiyu，WU Faju，LIU Xuerong* et al

（Zhongnong Weite Biotechnology Co.，Ltd.，Lanzhou，Gansu 730046）

AbstractThe origin，biological characteristics and culture methods of MDCK cells were reviewed，in order to provide the theoretical basis and foundation for the future culture of MDCK cells and largescale production of the influenza virus vaccine.

Key wordsMDCK cells；Biological characteristics；Serumfree medium；Microcarrier；Suspension culture

基金項目蘭州市科技計劃項目（2014-1-143）。

作者簡介萬玉林（1976—），男，甘肅蘭州人，碩士，從事口蹄疫疫苗生產(chǎn)與細胞培養(yǎng)工藝研發(fā)。*通訊作者，副研究員，從事國家重大動物疫病預(yù)防用生物制品技術(shù)研發(fā)。

收稿日期2017-06-20

自20世紀以來，全球共發(fā)生了4次流感大流行，每次流感大流行均嚴重危害人類和動物的健康，尤其是禽流感極大地威脅了公共衛(wèi)生安全，給全世界造成了巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫是預(yù)防流感大流行和季節(jié)性流行的有效手段。目前的流感疫苗主要是以雞胚為介質(zhì)制備的滅活疫苗，但是這種疫苗存在外源因子易污染、培養(yǎng)周期長、生產(chǎn)成本高、操作步驟繁瑣、疫苗批次間差異大、雞胚連續(xù)傳代病毒時易發(fā)生抗原變異且難以大量供應(yīng)等缺陷[1]。然而，隨著國內(nèi)外大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟和應(yīng)用，以細胞為介質(zhì)的流感病毒疫苗的制備已是必然趨勢，其中犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細胞是公認的最佳細胞系[2]。

MDCK細胞系是由Madin等[3]于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立而來，其通常是以貼壁方式培養(yǎng)生長的上皮樣細胞并能連續(xù)傳代。目前，MDCK細胞系被廣泛用于禽流感病毒、呼腸孤病毒、犬細小病毒、腺病毒及貓粒細胞缺乏癥病毒等病毒的分離、擴增和純化。由于MDCK細胞具有流感病毒易感染、易培養(yǎng)、增殖快及病毒不易變異等特點，被認為是最適合于A型和B型流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細胞系之一[4]。筆者綜述了犬腎細胞MDCK的來源、生物學(xué)特性及不同的培養(yǎng)方式，旨在為今后MDCK細胞的培養(yǎng)及流感病毒細胞介質(zhì)疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1MDCK細胞的來源

最初的MDCK細胞系是從犬的腎臟組織中分離獲得的，目前人們可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）、中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）、中國科學(xué)院上海細胞庫、北京協(xié)和細胞資源中心及武漢大學(xué)菌種保藏中心等保藏中心引進MDCK細胞系，擴大培養(yǎng)后用液氮或商品化的凍存培養(yǎng)液凍存后，建立自己的基礎(chǔ)種子細胞庫。

2MDCK細胞的生物學(xué)特性

2.1MDCK細胞的形態(tài)

MDCK細胞的來源不同，細胞的形態(tài)也不同；MDCK細胞形態(tài)一般較為規(guī)則，細胞較大，呈梭形或扁平狀，或呈多邊形，其中央有扁圓形的細胞核。

2.2MDCK細胞的生長特性

MDCK細胞通常以貼壁方式生長并可連續(xù)傳代，其在細胞方瓶中生長時細胞之間會相互銜接或呈鑲嵌狀而緊密排列，并會集合形成緊密的連接蛋白分泌到其表面，從而形成單層貼壁細胞。MDCK細胞的生長曲線呈S型，且染色體數(shù)目2n=78。當細胞密度在90%以上時，其通常用含0.02%EDTA的0.25%胰酶進行消化，室溫一般消化5～10 min，通常按1∶2～1∶4進行傳代。

2.3MDCK細胞的凍存和復(fù)蘇

凍存時MDCK細胞通常用含10%～20%的胎?；蛐律Ｑ?、5%～10%DMSO配制的凍存培養(yǎng)液置于液氮中凍存，并調(diào)節(jié)凍存液中細胞的終密度為5×106～1×107 cells /mL；復(fù)蘇時從液氮罐中取出凍存的細胞，直接浸入37 ℃溫水中，按照常規(guī)方法均能復(fù)蘇細胞，6 h后待細胞完全貼壁后，換加等量的新鮮營養(yǎng)液，以降低DMSO對細胞的毒性作用。

3MDCK細胞的培養(yǎng)方式

3.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方式

傳統(tǒng)的MDCK細胞培養(yǎng)大多采用有血清的單細胞層貼壁培養(yǎng)[5]。其中的血清由于是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物，含有細胞生長所需的生長因子、載體蛋白、激素、微量元素、貼壁因子以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，能夠有效促進細胞的生長和產(chǎn)物的表達，但血清的使用存在一系列問題：易受微生物、病毒和支原體等的污染；批次間的差異易使不同批次病毒疫苗的質(zhì)量難以嚴格控制；此外，大量血清蛋白的存在增加了生產(chǎn)疫苗過程中下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過分離純化被徹底去除，從而影響了產(chǎn)品的最終質(zhì)量；此外，血清來源困難、價格昂貴，導(dǎo)致大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)過程中使用血清時大大提高了生產(chǎn)成本。MDCK細胞有血清的貼壁培養(yǎng)目前僅適用于實驗室的科研研究。

3.2無血清貼壁培養(yǎng)

近年來，有關(guān)MDCK細胞的無血清貼壁培養(yǎng)技術(shù)取得了較大進展，適合MDCK細胞貼壁生長的幾種商品化無血清培養(yǎng)基相繼問世[6-8]。Gibco公司、Hyclone公司和Sigma-Aldrich公司分別研發(fā)出EpiSerf、SFM4MegaVir和Ex-Cell MDCK無血清培養(yǎng)基。MDCK細胞無血清培養(yǎng)基是在經(jīng)優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加重組人胰島素蛋白和牛轉(zhuǎn)鐵蛋白的低蛋白含量的成分配制而成。人們通過改變有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基在MDCK細胞培養(yǎng)過程中的比例，通過無血清貼壁馴化，MDCK細胞可以逐步適應(yīng)在無血清培養(yǎng)基中生長。研究表明，馴化后無血清貼壁生長的 MDCK細胞貼壁均勻，細胞邊緣輪廓模糊，細胞間的結(jié)合更加緊密，而在適應(yīng)前在有血清培養(yǎng)基中貼壁生長的MDCK細胞輪廓清晰，細胞間的結(jié)合不如無血清培養(yǎng)的MDCK細胞緊密。此外，在有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的MDCK細胞很難被胰酶消化，但在其無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞卻很容易被胰酶消化。相關(guān)研究也表明，MDCK細胞在無血清培養(yǎng)基中生長時細胞較小并緊密成團，但在無血清貼壁培養(yǎng)過程中細胞的延滯期明顯縮短、代謝副產(chǎn)物低、能夠更高效地利用培養(yǎng)基中的葡萄糖且能產(chǎn)生較高的細胞密度和比生長速率，對細胞生長有利，與此同時也克服了MDCK細胞在有血清貼壁培養(yǎng)中血清帶來的諸多不利因素，但其易受細胞培養(yǎng)基質(zhì)表面積及無血清培養(yǎng)基的化學(xué)成分不明確、價格昂貴等因素的限制，目前無血清貼壁培養(yǎng)也只適用于試驗研究，而不適用于MDCK細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，依然不能滿足病毒疫苗等生物制品生產(chǎn)的需要。

3.3微載體懸浮培養(yǎng)

微載體懸浮培養(yǎng)是目前比較先進的貼壁型細胞的培養(yǎng)技術(shù)，近年來國內(nèi)外有許多利用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)MDCK細胞生產(chǎn)流感疫苗等生物制品的報道，該技術(shù)能使MDCK細胞和流感病毒均大量增殖。

微載體是直徑60～250 μm的微珠。微載體本身所占體積不大（如1 g Cytodex 1用PBS水化后體積約為20 mL），但其比表面積很大，從而可以獲得較高密度的細胞。目前，微載體種類繁多，適合用于不同特性的細胞株。使用較多的是Cytodex型系列微載體（Cytodex 1、Cytodex 2、Cytodex 3），它們的基質(zhì)都由葡聚糖交聯(lián)而成，其上帶不同的基團而制成性質(zhì)不同的3種產(chǎn)品類型。Cytodex 1整個載體帶有正電荷，常用于傳代細胞（如Vero、CHO細胞）的培養(yǎng)；Cytodex 2僅表面帶有正電荷；Cytodex 3不帶電荷，其表面被一層膠原包裹，對細胞的貼附具有促進作用，因此更多地被用于無血清培養(yǎng)基微載體培養(yǎng)過程中。MDCK細胞培養(yǎng)使用最多的微載體是Cytodex 1和Cytodex 3。Cytodex 1由陽性二乙氨基乙基基團均勻分布于交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)上構(gòu)成，其電荷密度為1.5～2.0 meq/g。1 g Cytodex 1所提供的表面積為4 400 cm2，當濃度為3 g/L時最高細胞密度在4.0×106 cells/mL以上。

采用微載體培養(yǎng)動物細胞，結(jié)合了懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)勢。在MDCK細胞微載體懸浮培養(yǎng)時為了避免血清今后在疫苗生產(chǎn)過程中給下游純化工藝帶來的不利影響，相關(guān)研究人員通過探索培養(yǎng)基中能夠促進細胞貼壁的關(guān)鍵成分，并篩選出相關(guān)水解物，研發(fā)出適合MDCK細胞生長的低血清培養(yǎng)基M-LSM，結(jié)果表明，對于貼壁型細胞而言，能貼在其支持物表面是其能夠增殖的必要條件，而Ca2+和Mg2+是細胞在低血清培養(yǎng)基中貼壁生長時不可缺少的物質(zhì)；麥麩水解物可以部分代替培養(yǎng)基中的血清，且不影響MDCK細胞的生長[9]。在此基礎(chǔ)上，他們利用該低血清培養(yǎng)基通過微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)過消化轉(zhuǎn)移等操作實現(xiàn)了MDCK 細胞從5 L反應(yīng)器至25 L反應(yīng)器的放大培養(yǎng)，結(jié)果表明微載體上細胞貼附均勻、生長旺盛，在25 L反應(yīng)器中MDCK細胞培養(yǎng)48 h后細胞密度可以達到3.05×106cells /mL，該研究結(jié)果為更大體積的反應(yīng)器大規(guī)模地利用微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細胞提供了借鑒。另外，進行了微載體濃度優(yōu)化、接種細胞和微載體比例優(yōu)化、攪拌速度和攪拌方式優(yōu)化、換液策略優(yōu)化等培養(yǎng)工藝的研究，推動了MDCK細胞微載體懸浮培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

3.4單細胞懸浮馴化培養(yǎng)

MDCK細胞大規(guī)模培養(yǎng)常因其必須貼附生長而受到限制，前幾年較大規(guī)模的MDCK細胞生產(chǎn)流感疫苗常用微載體作為載體，支持MDCK細胞貼附生長。雖然微載體懸浮培養(yǎng)能使MDCK細胞獲得較高的細胞密度，但其消化過程復(fù)雜，從而增加了生產(chǎn)時間與生產(chǎn)成本，且步驟繁瑣。然而，單細胞懸浮培養(yǎng)不受細胞生長表面基質(zhì)的限制，易實現(xiàn)MDCK細胞的大規(guī)模生產(chǎn)。相關(guān)研究表明，可以通過直接法和間接法馴化MDCK細胞，使之在特定的細胞培養(yǎng)液單細胞懸浮培養(yǎng)。懸浮馴化的MDCK細胞經(jīng)逐級放大培養(yǎng)后，以之作為載體介質(zhì)可以制備出有效、安全和高產(chǎn)量的流感病毒疫苗。

在MDCK細胞單細胞懸浮培養(yǎng)馴化前，首先應(yīng)使其適應(yīng)在某種成分已知的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，此過程通過直接法和間接法馴化可以實現(xiàn)。直接法為完全替換培養(yǎng)液，21 d左右細胞生長速度即可恢復(fù)；間接法為逐步替換培養(yǎng)液，即改變有血清和無血清培養(yǎng)液的混合比例，用時2個月甚至更長[10]，細胞能適應(yīng)無血清培養(yǎng)液。然后，將適應(yīng)無血清培養(yǎng)液的MDCK細胞，按約0.5×106cells/mL的密度接種至250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)體積約60 mL，在細胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫下振蕩培養(yǎng)。為了避免細胞大量死亡，起始轉(zhuǎn)速設(shè)為30 r/min。馴化期間每天觀察MDCK細胞的生長情況，并使用測糖儀定期測定培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，當培養(yǎng)液中葡萄糖含量低于1.0 mg/mL時立即更換培養(yǎng)液。隨著細胞數(shù)量的不斷增加，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速也要逐漸增大，從30 r/min可變?yōu)?5 r/min直至60 r/min，防止細胞結(jié)團。相關(guān)研究表明，通過直接法和間接法馴化，適應(yīng)了無血清培養(yǎng)液的MDCK細胞經(jīng)進一步馴化后均能實現(xiàn)單細胞的懸浮培養(yǎng)，但直接法省時省力，間接法馴化周期較長。

相關(guān)研究也表明，單細胞懸浮馴化培養(yǎng)可通過硅化方瓶-搖床體系來實現(xiàn)。具體方法如下：為了阻止MDCK細胞貼壁，首先用硅化劑處理方瓶的表面；其次，通過調(diào)整無血清培養(yǎng)基的組分及濃度并不斷對其優(yōu)化，以便其能夠支持因硅化而未能貼壁的細胞增殖。先讓MDCK細胞在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)數(shù)小時后，再將細胞全部轉(zhuǎn)移至未經(jīng)處理的方瓶中，在搖床上懸浮振蕩培養(yǎng)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為60 r/min，在此期間前幾次不傳代，只換營養(yǎng)液，以保證足夠多的細胞，重復(fù)幾次后再將細胞上清中的懸浮細胞轉(zhuǎn)入硅化劑處理過的方瓶中，同樣置于搖床上懸浮振蕩培養(yǎng)，起初每48 h更換新鮮的營養(yǎng)液但不分傳，直至細胞的比生長速率趨于穩(wěn)定后，每次按約3.0×105 cells/mL的密度進行傳代培養(yǎng)，如此循壞往復(fù)將貼壁的MDCK細胞實現(xiàn)單細胞懸浮培養(yǎng)，并能穩(wěn)定增殖。

相關(guān)研究表明，與有血清和無血清貼壁培養(yǎng)方式相比，無血清單細胞懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞的延滯期大大縮短，葡萄糖比消耗速率也大幅度降低，生成代謝的副產(chǎn)物較少，細胞比生長率較高，活細胞密度和細胞活力進一步提高，其中無血清單細胞懸浮培養(yǎng)其最大細胞密度是有血清貼壁培養(yǎng)方式的3.6倍，這表明無血清單細胞懸浮培養(yǎng)更有利于MDCK細胞更高密度的生長和規(guī)模生產(chǎn)，能有效解決和避免大規(guī)模培養(yǎng)MDCK細胞過程中存在的諸多問題。

4結(jié)語

傳統(tǒng)的流感滅活疫苗均是利用9～11日齡的非免疫雞胚制備的，然而此種方法存在許多不足，如缺乏可靠的雞胚來源、繁瑣的操作步驟、較高的生產(chǎn)成本 、疫苗批次間較大的差異以及易污染等[11]。隨著國內(nèi)外大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟與發(fā)展，再加上MDCK細胞本身培養(yǎng)容易、流感病毒易感染、增殖快及病毒不易變異等特點，于是以MDCK細胞為介質(zhì)代替雞胚來生產(chǎn)流感疫苗是最佳方式。目前，已有MDCK細胞生產(chǎn)的流感疫苗相繼問世。

迄今為止，大規(guī)模的MDCK細胞生產(chǎn)流感疫苗主要利用微載體懸浮培養(yǎng)和單細胞懸浮培養(yǎng)方式，其培養(yǎng)過程中主要使用無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)過程可以限制和避免血清帶來的諸多不足，尤其是單細胞無血清懸浮培養(yǎng)方式由于具有細胞比生長率較高、能使細胞達到較高的密度和活力及代謝副產(chǎn)物少等優(yōu)點，因此其更有利于MDCK細胞高密度的培養(yǎng)和大規(guī)模生產(chǎn)，更有利于培養(yǎng)和擴增過程的優(yōu)化和放大，并能支持流感病毒的復(fù)制及獲得較高的滴度，對大規(guī)模懸浮培養(yǎng)MDCK細胞增殖流感病毒及制備安全、有效、高質(zhì)量和高產(chǎn)量的流感疫苗具有重要的應(yīng)用價值，同時也為利用其他動物細胞來大規(guī)模生產(chǎn)病毒疫苗等生物制品提供了依據(jù)和借鑒。

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