鞏仔鵬 熊荻菲菲　李梅 吳林霖　陳亭亭　李月婷　陳思穎　王愛民　李勇軍

摘要 [目的] 分析羊耳菊有效組分中的化學(xué)成分。[方法]采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，對其中主要的化學(xué)成分進(jìn)行表征，指認(rèn)其中特征性、代表性的化學(xué)成分，并通過對照品進(jìn)行比對。[結(jié)果]在羊耳菊有效組分中鑒定出12個化合物，分別為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、洋薊素、木犀草苷、東莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。 [結(jié)論]明確了羊耳菊有效組分中的12個化合物，為羊耳菊藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)成分的選擇提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 羊耳菊；超高效液相色譜—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜；化學(xué)成分

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）29-0131-03

1.2.4 質(zhì)譜條件。

采用電噴霧離子源，掃描方式為正、負(fù)離子掃描（ESI+、ESI-，m/z 50～1 000），毛細(xì)管電壓（正離子模式4 kV，負(fù)離子模式3.5 kV），錐孔電壓80 V，離子源溫度110 ℃，霧化氣（N2）壓力1.3 bar，流速6 L/min，溫度180 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，氣體體積流量50 L/h，脫溶劑氣體積流量550 L/h，用甲酸鈉校正質(zhì)量數(shù)，校正模式選用Enhanced Quadratic，數(shù)據(jù)分析采用Data Analysis軟件、Metabolite ToolsTM（包括Metabolite Predict及Metabolite Detect）軟件、質(zhì)量虧損過濾（MDF）。

1.2.5 樣品測定。

分別吸取羊耳菊活性組分樣品溶液和混合對照品溶液各2 μL 于Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨質(zhì)譜儀，采用標(biāo)準(zhǔn)對照品、分析正負(fù)離子模式掃描及碎片離子分析等方法，對羊耳菊有效組分進(jìn)行化學(xué)成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正負(fù)離子模式的選擇

從羊耳菊有效組分的正離子和負(fù)離子模式色譜圖（圖1）可以看出，試驗在相同條件下，正離子模式下綜合的各成分響應(yīng)較負(fù)離子模式的大，因此試驗選擇正離子模式為測試模式。

2.2 羊耳菊有效組分質(zhì)譜信息分析

通過對有效組分正離子模式的一級質(zhì)譜進(jìn)行分析，同時結(jié)合文獻(xiàn)分析大致推斷出各成分信息，結(jié)果見表2。

分析圖2中標(biāo)記的12個峰發(fā)現(xiàn)，峰5、8、9和11均為二咖啡?；鼘幩犷愅之悩?gòu)體，去質(zhì)子化的分子離子m/z為515，結(jié)合文獻(xiàn)[5，7-9]了解到羊耳菊中分離得到的二咖啡奎寧酸有異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、洋薊素等，因此，進(jìn)一步結(jié)合對照品比對，確認(rèn)了峰5為洋薊素，峰8為異綠原酸B，峰9為異綠原酸A，峰11為異綠原酸C。峰1、2、3、4的去質(zhì)子化的分子離子m/z 都為353，而羊耳菊現(xiàn)有文獻(xiàn)報道中僅有東莨菪苷這一個化合物的分子量與其一致[7]，而m/z 353為二咖啡?；鼘幩犷愂?1個分子咖啡酸得到m/z 353的單咖啡?；鼘幩崛ベ|(zhì)子化碎片，因此推測這4個峰中有一個為東莨菪苷，其余3個可能為單咖啡?；鼘幩犷惢衔铮兴幹谐Ｒ姷膯慰Х弱；鼘幩嵊芯G原酸、隱綠原酸等。因此，進(jìn)一步結(jié)合對照品比對，確認(rèn)了峰1為新綠原酸、峰2為東莨菪苷、峰3為綠原酸、峰4為隱綠原酸。

峰6、7、10、12均為黃酮類化合物，峰7在正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ m/z 449，提取出可能的分子式為C21H20O11，與文獻(xiàn)報道[8]相比較，推測其為木犀草素C15H10O16得到一個葡萄糖，因此初步推斷該成分為木犀草苷，之后通過對照品進(jìn)行比對，進(jìn)一步驗證了推斷結(jié)果。峰6在保留時間為8.1 min時，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ m/z 595，其碎片離子峰為[M+H]+m/z 449、m/z 287，m/z 449為m/z 595失去1個分子鼠李糖，而m/z 449為木犀草苷，與參考文獻(xiàn)[10]一致，故可以推測峰6為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷。峰10在保留時間9.3 min時，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z 463，正離子模式下的二級質(zhì)譜碎片峰主要為[M+H]+m/z 287，峰10失去1個分子葡萄糖醛酸得到m/z 287的碎片離子，結(jié)合參考文獻(xiàn)[11]，推測峰10為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。峰12在保留時間為128 min時，正離子模式下得到準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ m/z 433，正離子模式二級碎片離子主要為[M+H]+m/z 271，結(jié)合參考文獻(xiàn)[11]，推測其為m/z 433失去1個分子葡萄糖得到m/z 271的芹菜素加氫的碎片離子，推測峰12為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

3 討論

復(fù)雜中藥體系的分析一直是分析領(lǐng)域的熱點和難點，也是中藥現(xiàn)代化的瓶頸之一，而中藥藥物化學(xué)成分的分析和驗證是整個藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)[12-13]。UHPLC-Q-TOF-MS與其他方法相比，由于其離子傳輸效率高、重現(xiàn)性高、靈敏度高、錯誤率低等優(yōu)點，其在復(fù)雜中藥體系的分析中具有明顯優(yōu)勢。因此，該研究采用超高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）儀對羊耳菊抑菌、抗炎有效組分的化學(xué)成分進(jìn)行分析，建立了一種快速、高效、準(zhǔn)確的化學(xué)成分分析方法。

研究采用高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量和同位素峰型匹配，對有效組分中特征性、代表性的化學(xué)成分進(jìn)行了高分辨質(zhì)譜表征，初步確定化合物的分子式，同時結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，確認(rèn)了其中12種化合物。由于提取物中存在著大量結(jié)構(gòu)類似的同分異構(gòu)體，不但分子式一樣，并且有相似的裂解方式，如新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，因此，該試驗采用對照品比對，將其區(qū)分和進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，12種化合物分別為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、洋薊素、木犀草苷、東莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

在羊耳菊抗炎有效組分中酚酸類化合物綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A等為其主要化學(xué)成分。在同科植物金銀花中已有文獻(xiàn)報道，金銀花中含有的大量苯丙素類化合物，其中綠原酸、異綠原酸和咖啡酸等是其主要抗炎活性成分之一，同時文獻(xiàn)研究證明，金銀花具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，且抗菌活性的強(qiáng)弱也與苯丙素類化合物（綠原酸、異綠原酸等）的含量顯著相關(guān)[14-16]。因此，初步推斷羊耳菊的抑菌、抗炎藥效與苯丙素類化合物有一定聯(lián)系，該研究為羊耳菊抑菌、抗炎活性成分的發(fā)現(xiàn)奠定試驗基礎(chǔ)，初步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并為下一步質(zhì)量控制研究提供了特征性的代表指標(biāo)成分。

參考文獻(xiàn)

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Analysis of Chemical Constituents of Effective Components of Inula cappa

GONG Zipeng1，2，3，4， XIONG Difeifei1，2，3，4， LI Mei1，2，3，4，LAN Yanyu1，2，3，4* et al

（1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；3. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang，Guizhou 550004；4. National Engineering Research Center of Miaos Medicines， Guiyang，Guizhou 550004）

Abstract [Objective] To analyze the chemical constituents of effective components of Inula cappa. [Method] The main chemical constituents were characterized by UHPLCQTOFMS， and the characteristic and representative chemical constituents were identified by comparing with the standard material. [Results] Twelve compounds were identified in the active components of Inula cappa， namely chlorogenic acid， neochlorogenic acid，cryptochlorogenic acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid B， isochlorogenic acid C， cinarine，luteolin7glucoside， scopolin， luteolin7OβDGlucose（6→1）αLRhodiosin，luteolin7OβDGlucose，apigenin7OβDglucoside. [Conclusion] The twelve compounds in the active components of Inula cappa were identified， which provided the basis for the selection of the quality control index components of Inula cappa.

Key words Inula cappa；UHPLCQTOFMS；Chemical constituents

基金項目 國家自然科學(xué)基金項目（81360680）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項目 （黔科合人字〔2015〕11號）；貴州省民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊（黔科合平臺人才〔2016〕5613）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)（百層次黔科合平臺人才〔2016〕 5677）；貴州省科技合作計劃項目（黔科合LH字〔2015〕7362）。

作者簡介 鞏仔鵬（1985—），男，安徽界首人，副教授，博士，從事中藥藥代動力學(xué)研究。

*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開發(fā)研究。

收稿日期 2017-08-30

羊耳菊為菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草，又名山白芷、白牛膽、見腫消，其性辛、微苦，具有解毒、散熱、祛風(fēng)痰等作用，主要用于治療咽喉腫痛、感冒發(fā)熱等。羊耳菊為貴州省少數(shù)民族常用藥物，以全草或根莖入藥，其具有良好的抗菌、抗炎等藥用價值，所以多種中成藥把羊耳菊作為主要的原料藥，如蓮菊感冒膠囊、菊黃上清含片等，羊耳菊還作為主藥入藥于貴州省百靈制藥的雙羊喉痹通顆粒中，該產(chǎn)品已上市且取得良好的銷量紀(jì)錄[1-4]。關(guān)煥玉等[5]對羊耳菊進(jìn)行了許多研究，確定羊耳菊藥材活性部位的提取方式為60%乙醇提取、D101大孔樹脂吸附、60%乙醇洗脫可得活性部位提取物。但羊耳菊基礎(chǔ)研究薄弱一直是亟待解決的技術(shù)問題，特別是羊耳菊有效組分的化學(xué)成分一直未能明確，很難保證羊耳菊及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量和療效[6]，并已成為制約羊耳菊相關(guān)制劑升級換代和產(chǎn)業(yè)鏈做大做強(qiáng)的瓶頸。因此，該研究將運用超高效液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）對該組分的化學(xué)成分進(jìn)行分析，對其中主要的化學(xué)成分進(jìn)行表征，指認(rèn)其中特征性、代表性的化學(xué)成分，并通過對照品進(jìn)行比對，以期為以后基于有效成分的羊耳菊藥材質(zhì)量控制研究提供合理的化學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。

超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、色譜柱恒溫箱、Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨質(zhì)譜儀等）；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Q-250A-ST超聲波清洗器（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；EL240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；EL204萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.1.2 試材。羊耳菊藥材購自貴州龍里縣，經(jīng)過貴州省食品藥品檢驗所中藥標(biāo)本館館長李楊主任藥師鑒定為菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草。新綠原酸（四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%，批號150426）；東莨菪苷（上海同田生物技術(shù)有限公司，含量≥98%，批號13061422）；綠原酸（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，含量≥98%，批號MUST-11042802）；隱綠原酸（四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%，批號150922）；洋薊素（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，含量≥98%，批號D15-20130213）；木犀草苷（中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%，批號111720-200602）；異綠原酸B（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，含量≥98%，批號Y59-20130115）；異綠原酸A（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，含量≥96.7%，批號111782-201203）；異綠原酸C（中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，含量≥94.1%，批號111894-201102）。

1.1.3 試劑。乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，美國TEDIA有限公司）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。

分別精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、洋薊素、木犀草苷、東莨菪苷對照品適量置于10 mL容量瓶中，少量甲醇超聲溶解后，用甲醇定容至刻度，制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備。

稱取羊耳菊有效組分浸膏適量，用50%甲醇溶解，制得濃度為0.5 mg/mL，超聲溶解后，以15 000 r/min離心10 min 取上清液，即得供試品。

1.2.3 色譜條件。

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL，流動相為0.1 %甲酸水（A）-0.1 %甲酸乙腈（B），按表1中的程序梯度洗脫。

了其中12種化合物。由于提取物中存在著大量結(jié)構(gòu)類似的同分異構(gòu)體，不但分子式一樣，并且有相似的裂解方式，如新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，因此，該試驗采用對照品比對，將其區(qū)分和進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，12種化合物分別為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、洋薊素、木犀草苷、東莨菪苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖（6→1）-α-L-鼠李糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

在羊耳菊抗炎有效組分中酚酸類化合物綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A等為其主要化學(xué)成分。在同科植物金銀花中已有文獻(xiàn)報道，金銀花中含有的大量苯丙素類化合物，其中綠原酸、異綠原酸和咖啡酸等是其主要抗炎活性成分之一，同時文獻(xiàn)研究證明，金銀花具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，且抗菌活性的強(qiáng)弱也與苯丙素類化合物（綠原酸、異綠原酸等）的含量顯著相關(guān)[14-16]。因此，初步推斷羊耳菊的抑菌、抗炎藥效與苯丙素類化合物有一定聯(lián)系，該研究為羊耳菊抑菌、抗炎活性成分的發(fā)現(xiàn)奠定試驗基礎(chǔ)，初步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并為下一步質(zhì)量控制研究提供了特征性的代表指標(biāo)成分。

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