杜睿綺　王芯蕾　許謙

摘要 [目的]對桑黃進(jìn)行液體培養(yǎng)基的擴(kuò)大培養(yǎng)，分析擴(kuò)大培養(yǎng)過程中黃酮產(chǎn)量的變化。[方法] 250、500、1 000 mL 3種錐形瓶分別裝液體培養(yǎng)基150、300、600 mL，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。采用有機(jī)溶劑浸提法提取黃酮，分光光度法測定黃酮產(chǎn)量。[結(jié)果]在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，桑黃胞內(nèi)和胞外黃酮產(chǎn)量均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。[結(jié)論]該研究結(jié)果對桑黃胞內(nèi)和胞外黃酮的生產(chǎn)、提取及應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞 桑黃；液體培養(yǎng)基；擴(kuò)大培養(yǎng)；黃酮產(chǎn)量

中圖分類號 S567.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）29-0109-03

Study on the Change of Flavonoids Production in the Expanding Culture Process of Phellinus igniarius

DU Ruiqi1，WANG Xinlei2，XU Qian2*

（1.2015 Hongzhi Level，Heze No.1 Middle School， Heze，Shandong 274000；2.Department of Life Science，Agriculture and Bioengineering College， Heze University，Heze，Shandong 274000）

Abstract [Objective] The research aimed to expand the culture medium of Phellinus igniarius and analyze the change of flavonoid production during the culture process.[Method]150， 300， 600 mL liquid medium were stalled in 250， 500， 1 000 mL flasks respectively and incubated under 28 ℃， 180 r/min conditions. Organic solvent extraction was used to extract flavonoids and spectrophotometry was used to measure flavonoids production.[Result]In the process of expanding the culture， the intracellular and extracellular flavonoids production of Phellinus igniarius showed a tendency to decrease first and then rise.[Conclusion] The results of this study have guiding significance for the production， extraction and application of intracellular and extracellular flavonoids from Phellinus igniarius.

Key words Phellinus igniarius；Liquid culture medium；Expanded culture；Flavonoid production

基金項目 山東省重點(diǎn)研發(fā)項目（2016GNC113019）；菏澤市科技發(fā)展計劃項目（2012N002）。

作者簡介 杜睿綺（2000—），女，山東菏澤人，高中生。*通訊作者，副教授，碩士，從事食藥用菌開發(fā)應(yīng)用、微生物遺傳育種研究。

收稿日期 2017-08-21

桑黃屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱[1]，是國際公認(rèn)的藥用真菌[2]，因寄生于桑樹而得名。黃酮是一種多酚類化合物，它主要存在于天然植物中。研究表明，黃酮在防止細(xì)胞衰老、增加免疫力、降低血脂血糖和擴(kuò)張血管等方面有重要作用[3]。桑黃的黃酮含量高于其他真菌。我國野生桑黃資源匱乏[4]，產(chǎn)量非常有限，加上人工栽培要求高、周期長，限制了對桑黃的開發(fā)利用，難以成為穩(wěn)定的工業(yè)產(chǎn)品來源[5]。有學(xué)者證實(shí)桑黃菌絲體活性成分與子實(shí)體類似，且菌絲體浸提物同樣具有清除氧自由基、改善血液循環(huán)等作用[4]。有人研究過高產(chǎn)桑黃黃酮菌株深層發(fā)酵條件的優(yōu)化以及桑黃黃酮的高效提取和分析方法[6-7]，但桑黃擴(kuò)大培養(yǎng)過程中黃酮產(chǎn)量的變化研究還是一個空白。筆者通過對桑黃進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，研究擴(kuò)大培養(yǎng)過程中胞內(nèi)和胞外黃酮產(chǎn)量的變化規(guī)律，為工業(yè)化生產(chǎn)桑黃黃酮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 桑黃菌種。保存于菏澤學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室的固體斜面桑黃菌種。

1.1.2 試劑。95%乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；無水三氯化鋁（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂粉（生化試劑，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蛋白胨（生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；MgSO4（分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；KH2PO4（分析純， 西隴化工股份有限公司）；98%蘆?。ɑ瘜W(xué)對照品，阿拉丁試劑有限公司）；玉米粉、麩皮、馬鈴薯提取液，煮沸30 min后由紗布過濾得到。

1.1.3 儀器。HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；HZQ-Y全溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；7230G可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SHHW21-CR420電熱恒溫水浴箱（北京長安科學(xué)儀器廠）；MLS-3780全自動高壓蒸汽滅菌鍋（日本）；CJ-2D凈化工作臺（天津市泰新特儀器有限公司）；TGL-16C高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 平板培養(yǎng)方法。保存于實(shí)驗(yàn)室的固體斜面桑黃菌種轉(zhuǎn)接至馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），用接種鏟取出均勻菌塊接種于平板中央[8]，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，測定桑黃生長直徑，并觀察生長狀況。

1.2.2 液體培養(yǎng)方法。擴(kuò)大培養(yǎng)過程中所用的液體培養(yǎng)基為菏澤學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室在前人研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)的[9]。培養(yǎng)基配方：玉米粉30 g/L、麩皮70 g/L、蛋白胨20 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 1.5 g/L，pH自然。

待桑黃菌落直徑達(dá)到平板直徑，無菌條件下，用直徑為1 cm 的打孔器打出菌柄，分別接種于250 mL錐形瓶內(nèi)150 mL的液體培養(yǎng)液中（每瓶接2個菌柄）、500 mL錐形瓶內(nèi)300 mL的液體培養(yǎng)液中（每瓶接4個菌柄）、1 000 mL錐形瓶內(nèi)600 mL的液體培養(yǎng)液中（每瓶接8個菌柄），28 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)18 d。

1.2.3 桑黃菌絲粉末的制備。培養(yǎng)18 d的菌液經(jīng)八層紗布過濾（濾液保留），用蒸餾水洗滌3次，置于已知重量的培養(yǎng)皿中，60 ℃下恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，冷卻后稱菌絲體質(zhì)量，研缽研碎后過60目篩得到。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱量蘆丁10.0 mg（烘干至恒重），70%乙醇定容至100 mL，終濃度為0.1 mg/mL；稱取AlCl3 1.34 g，70%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mol/L的溶液；分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL的容量瓶，并加入4 mL的0.1 mol/L AlCl3溶液，70%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，410 nm下測定吸光度。以蘆丁實(shí)際濃度（C）對吸光度（Y）做線性回歸，得到線性回歸方程為Y=0.002 8C+0.002 3，R2=0.999 6（圖1）。

1.2.5 桑黃黃酮含量的測定。

1.2.5.1

胞外黃酮測定[10]。無菌操作下取胞外液，

4 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入4 mL 0.1 mol/L顯色液AlCl3，70%乙醇定容至10 mL，40 ℃水浴顯色10 min，測定其410 nm處的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得黃酮的濃度，再換算成黃酮產(chǎn)量。

1.2.5.2

胞內(nèi)黃酮測定。采用有機(jī)溶劑浸提法提取黃酮。取菌絲粉末0.5 g，20倍體積70%乙醇、80 ℃溫度下浸提2 h[11-12]，浸提液4 000 r/min離心10 min，取上清，之后操作步驟同“ 1.2.5.1 ”。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃擴(kuò)大培養(yǎng)過程中形態(tài)觀察

2.1.1 桑黃菌種活化過程中形態(tài)變化。圖2展示了桑黃在固體培養(yǎng)基上第4天、第6天、第8天、第10天的生長形態(tài)，長勢良好，菌落直徑逐漸增大。

2.1.2 桑黃液體培養(yǎng)過程中形態(tài)變化。圖3展示了桑黃在液體培養(yǎng)基第4天、第8天、第12天、第16天的生長狀況。菌液由棕色逐漸變?yōu)樽睾稚?。菌絲體逐漸增加，其形態(tài)呈球形（平均直徑約為0.25 cm）或柱形（長和寬分別約為0.35和0.20 cm）。

2.2 桑黃擴(kuò)大培養(yǎng)過程中黃酮的產(chǎn)量

2.2.1 胞外黃酮的產(chǎn)量。把OD值代入線性回歸方程Y=0.002 8C+0.002 3，經(jīng)單位換算即可得到黃酮產(chǎn)量。從表1可以看出，3種不同體積的液體培養(yǎng)基胞外黃酮的產(chǎn)量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。

2.2.2 胞內(nèi)黃酮的含量。把OD值代入線性回歸方程Y=0.002 8C+0.002 3，得到的C乘以浸提液的體積為0.5 g菌絲對應(yīng)的黃酮產(chǎn)量，再經(jīng)換算得出胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量。從表2可以看出，3種不同體積液體培養(yǎng)基的胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量也呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。

3 討論與結(jié)論

此次試驗(yàn)中，桑黃胞外黃酮產(chǎn)量略高出文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]，桑黃菌絲體的黃酮產(chǎn)量比文獻(xiàn)資料中偏低[8]。一方面可能由于試驗(yàn)菌種不同所致，另一方面可能與桑黃菌絲體黃酮提取方法不同有關(guān)。

根據(jù)測量數(shù)據(jù)，250、500、1 000 mL 3種錐形瓶胞外黃酮產(chǎn)量分別為0.231、0.113、0.213 mg/mL，胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量分別為0.021、0.014、0.037 mg/mL，均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢。

黃酮產(chǎn)量與液體培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)天數(shù)、浸提方法、測量方法均有密切關(guān)系，此次擴(kuò)大培養(yǎng)過程中除錐形瓶裝培養(yǎng)基量不同外，上述條件均相同。黃酮產(chǎn)量隨著液體培養(yǎng)基體積的成倍增加呈先下降再上升的變化趨勢，可能與桑黃黃酮代謝有關(guān)，桑黃調(diào)節(jié)其代謝機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境和滿足自身生長繁殖對黃酮的需求。

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