丁林芬 吳興德 王雙燕 涂文超 潘爭紅 郭亞東 宋流東

摘要： 采用正相硅膠、MCI、反相RP18和半制備液相等色譜技術(shù)， 對(duì)柏科翠柏屬植物翠柏（Calocedrus macrolepis）中的二萜類成分及其抗炎活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從中共分離得到8個(gè)二萜類化合物，分別鑒定為8hydroxylabda13（16），14dien19yl transcoumarate （1）、transcommunal （2）、transcommunic acid （3）、pinusolidic acid （4）、isocupressic acid （5）、fokihodgin F （6）、acetylisocupressic acid （7）、15，16dihydroxylabda8（17），13（E）dien19oic acid （8）?；衔?～8均為首次從該植物中分離得到。化合物7對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO具有顯著的抑制作用，其IC50值為9.31 μmol·L1。

關(guān)鍵詞： 柏科， 翠柏屬， 翠柏， 二萜， 成分， 抗炎活性

中圖分類號(hào)： Q946， R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05064206

Abstract： To study the diterpenoids from Calocedrus macrolepis and their antiinflammatory activities， the constituents were separated by silica gel， MCI， RP18， semipreparative HPLC and eight compounds were isolated. Their structures were characterized as： 8hydroxylabda13（16），14dien19yl transcoumarate （1）， transcommunal （2）， transcommunic acid （3）， pinusolidic acid （4）， isocupressic acid （5）， fokihodgin F （6）， acetylisocupressic acid （7）， 15，16dihydroxylabda8（17），13（E）dien19oic acid （8）. Compounds 18 were obtained from this plant for the first time. Among them， Compound 7 exhibited potent inhibitory effect on NO production in LPSinduced macrophages with IC50 values of 9.31 μmol·L1.

Key words： Cupressaceae， Calocedrus， C. macrolepis， diterpenoids， constituents， antiinflammatory activity

柏科（Cupressaceae）翠柏屬（Calocedrus）植物全球共2種和1變種，在我國分布的有翠柏（C. macrolepis）及其變種臺(tái)灣翠柏（C. macrolepis var. formosana）。翠柏為常綠喬木，高大挺拔，樹形優(yōu)美，是極好的庭園樹種，其樹干可供建筑、橋梁、板料、家具等使用 （中國植物志編輯委員會(huì)，1978）。翠柏是一種古老的孑遺植物，1986年被《中國珍稀瀕危植物名錄》劃定為國家三級(jí)保護(hù)植物，1999年《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》將其列為國家二級(jí)保護(hù)植物，目前發(fā)現(xiàn)其主要分布于云南、貴州、廣西及廣東等地。翠柏屬植物臺(tái)灣翠柏的化學(xué)成分和藥理作用研究較多（Hsieh et al， 2005， 2006， 2011），但關(guān)于翠柏化學(xué)成分的研究報(bào)道較少。王蕾等（2013）和Wu et al（2013）前期對(duì)翠柏進(jìn)行初步化學(xué)成分研究，從中發(fā)現(xiàn)木脂素、萜類及酚類化合物。

為了合理開發(fā)利用該植物，本課題組在前期的基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)翠柏進(jìn)行較深入的化學(xué)成分研究，從其95%乙醇提取物中分離得到8個(gè)二萜類化合物，分別鑒定為8hydroxylabda13（16），14dien19yl transcoumarate （1）、transcommunal （2）、transcommunic acid （3）、pinusolidic acid （4）、isocupressic acid （5）、fokihodgin F （6）、acetylisocupressic acid （7）、15，16dihydroxylabda8（17），13（E）dien19oic acid （8）。所有化合物均為首次從該植物中分離得到。同時(shí)，對(duì)分離得到的8個(gè)化合物進(jìn)行抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)化合物7具有顯著的抑制作用，其IC50值為9.31 μmol·L1，提示該植物具有潛在的抗炎活性。本研究進(jìn)一步豐富了翠柏的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其今后的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

翠柏枝葉于2010年12月采自云南昆明植物園，并由中國科學(xué)院昆明植物研究所龔洵研究員鑒定，標(biāo)本存放在昆明植物研究所植物化學(xué)與西部資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

美國APIQSTARTOF質(zhì)譜儀，瑞士Bruker AM400核磁共振儀，瑞士Bruker AM500核磁共振儀，Agilent1200高效液相色譜儀，硅膠（100～200、200～300目）及TLC檢測(cè)用硅膠GF254均為青島海洋化工廠，反相填充材料RP18為Merk公司生產(chǎn)，MCI填充材料為MCIgel CHP20P，所有試劑均為分析純。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，Griess Reagent、LPS和MG132購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離干燥翠柏枝葉樣品15 kg，粉碎后用95% 乙醇（每次50 L） 在室溫下冷浸3次，合并提取液，減壓蒸餾濃縮除去有機(jī)溶劑后得粗提物，將該粗提物分配于水中，用乙酸乙酯萃取3次（每次5 L），得乙酸乙酯部分620 g。該部分用丙酮溶解，以石油醚-丙酮（1∶0→0∶1）為流動(dòng)相梯度洗脫，得到5個(gè)部分（A～E）。餾分B（110 g）經(jīng)中壓液相色譜（MCI柱），用不同比例的甲醇水洗脫，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分得到3個(gè)組分B1～B3。B1部分靜置過夜，從中析出大量白色方晶，在石油醚-丙酮中重結(jié)晶得到化合物3 （15 mg），其母液經(jīng)正相硅膠柱層析（石油醚-丙酮=20∶1）得到化合物2 （6 mg）。B2部分在甲醇析出一結(jié)晶并經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶得到化合物1 （25 mg）。餾分C（85 g）經(jīng)中壓液相色譜（MCI柱），用不同比例的甲醇水洗脫，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相同部分得到3個(gè)組分C1～C3。C1經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯（9∶1→7∶3）洗脫，得到化合物8（24 mg）。C2部分經(jīng)反復(fù)正相硅膠柱層析（石油醚-丙酮，氯仿-丙酮）和Sephadex LH20（氯仿∶甲醇=1∶1，或純甲醇）凝膠純化后得到化合物4 （21 mg），5 （70 mg），6 （40 mg），7 （5 mg）。

1.2.2 抗炎活性實(shí)驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞為檢測(cè)模型，通過Griess試劑顯色法檢測(cè)NO的生成量（楊曉露等，2013），同批細(xì)胞應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力（Mosmann，1983）。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將對(duì)數(shù)生長的RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板，用1 μg·mL1 LPS進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時(shí)加入待測(cè)化合物處理（25 μmol·L1），并設(shè)不加藥物組作對(duì)照；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸取上清液，加入Griess試劑，混勻，避光靜置10 min，在570 nm波長下，利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取各孔吸光收值。NO生成抑制率 （%） = （非藥物處理組OD570 nm-樣品組OD570 nm）/非藥物處理組OD570 nm × 100%。對(duì)NO生成抑制率超過50%的化合物，設(shè)置1.56、3.12、6.25、12.50、25.00 μmol·L1等5個(gè)濃度梯度，進(jìn)一步測(cè)定各濃度下的吸光值，應(yīng)用Reed & Muench法計(jì)算IC50值（Reed & Muench， 1938）。

2結(jié)構(gòu)鑒定和抗炎活性測(cè)試

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1白色粉末。ESIMS m/z： 475 [M + Na]+， 491 [M + K]+； 1H NMR （500 MHz， C5D5N） δ： 6.51 （1H， dd， J=17.5， 10.8 Hz， H14）， 5.17 （1H， d， J=10.8 Hz， H15a）， 5.63 （1H， d， J=17.5 Hz， H15b），

4.98 （1H， br s， H16a）， 5.10 （1H， br s， H16b）， 1.29 （3H， br s， CH317）， 1.08 （3H， br s， CH318）， 4.19 （1H， d， J=11.5 Hz， H19a）， 4.55 （1H， d， J=11.5 Hz， H19b）， 0.84 （3H， s， CH320）， 6.72 （1H， d， J=16.0 Hz， H2′）， 8.03 （1H， d， J=16.0 Hz， H3′）， 7.67 （2H， d， J = 8.4 Hz， H5′， H9′）， 7.19 （2H， d， J=8.4 Hz， H6′， H8′）； 13C NMR（125 MHz， C5D5N） δ： 39.9 （C1）， 18.5 （C2）， 36.5 （C3）， 37.6 （C4）， 57.1 （C5）， 21.2 （C6）， 45.5 （C7）， 73.1 （C8）， 62.4 （C9）， 39.1 （C10）， 25.5 （C11）， 35.9 （C12）， 148.4 （C13）， 139.6 （C14）， 115.8 （C15）， 113.9 （C16）， 24.5 （C17）， 27.7 （C18）， 66.7 （C19）， 16.3 （C20）， 167.7 （C1′）， 115.4 （C2′）， 145.3 （C3′）， 126.2 （C4′）， 130.8 （C5′ and C9′）， 116.9 （C6′and C8′）， 161.6 （C7′）。以上數(shù)據(jù)與Feliciano et al （1988）報(bào)道一致，故鑒定化合物1為8hydroxylabda13（16），14dien19yl transcoumarate。

化合物 2白色固體。ESIMS m/z： 331 [M + HCOO]—； 1H NMR （400 MHz， CD3OD） δ： 5.38 （1H， t， J=6.4 Hz， H12）， 6.29 （1H， dd， J=17.3， 10.8 Hz， H14）， 5.03 （1H， d， J=17.3 Hz， H15a）， 4.85 （1H， d， J=10.8 Hz， H15b）， 4.84 （1H， s， H17a）， 4.49 （1H， s， H17b）， 1.74 （3H， s， CH316）， 1.02 （3H， s， CH318）， 0.62 （3H， s， CH320）； 13C NMR （100 MHz， CD3OD） δ： 39.3 （C1）， 20.4 （C2）， 35.4 （C3）， 48.6 （C4）， 57.2 （C5）， 39.8 （C6）， 24.4 （C7）， 148.9 （C8）， 57.2 （C9）， 41.1 （C10）， 25.0 （C11）， 134.7 （C12）， 134.6 （C13）， 142.8 （C14）， 110.4 （C15）， 12.1 （C16）， 108.9 （C17）， 24.8 （C18）， 207.4 （C19）， 14.2 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Chiang et al （2003）報(bào)道一致，故鑒定化合物2為transcommunal。

化合物3無色油狀物。 ESIMS m/z： 301 [MH]—； 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 5.42 （1H， t， J = 6.4 Hz， H12）， 6.29 （1H， dd， J=17.4， 10.8 Hz， H14）， 5.01 （1H， d， J = 17.4 Hz， H15a）， 4.98 （1H， d， J=10.8 Hz， H15b）， 1.71 （3H， s， CH316）， 4.80 （1H， s， H17a）， 4.43 （1H， s， H17b）， 1.11 （3H， s， CH318）， 0.62 （3H， s， CH320）； 13C NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 39.2 （C1）， 19.9 （C2）， 38.4 （C3）， 44.0 （C4）， 56.3 （C5）， 37.9 （C6）， 25.8 （C7）， 147.9 （C8）， 56.1 （C9）， 40.3 （C10）， 23.2 （C11）， 133.9 （C12）， 133.3 （C13）， 141.5 （C14）， 109.8 （C15）， 11.7 （C16）， 107.5 （C17）， 29.0 （C18）， 182.4 （C19）， 12.8 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Fukushima et al （2002）報(bào)道一致，故鑒定化合物3為transcommunic acid。

化合物4白色粉末。 ESIMS m/z： 331 [MH]—； 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 7.10 （1H， s， H14）， 4.75 （2H， s， H15a and H15b）， 4.87 （1H， br s， H17a）， 4.57 （1H， br s， H17b）， 1.20 （3H， s， CH318）， 0.58 （3H， s， CH320）； 13C NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 39.1 （C1）， 19.8 （C2）， 38.6 （C3）， 44.0 （C4）， 56.3 （C5）， 25.8 （C6）， 37.9 （C7）， 147.3 （C8）， 56.1 （C9）， 40.3 （C10）， 21.8 （C11）， 28.9 （C12）， 144.0 （C13）， 134.7 （C14）， 70.1 （C15）， 174.4 （C16）， 106.8 （C17）， 28.9 （C18）， 184.3 （C19）， 12.7 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Fang et al （1989）報(bào)道一致，故鑒定化合物4為pinusolidic acid。

化合物5白色粉末。ESIMS m/z： 319 [MH]—； 1H NMR （400 MHz， CD3OD） δ： 5.31 （1H， m， H14）， 4.07 （2H， d， J = 6.8 Hz， H15a and H15b）， 1.66 （3H， s， CH316）， 4.54 （1H， br s， H17a）， 4.86 （1H， br s， H17b）， 1.20 （3H， s， CH318）， 0.63 （3H， s， CH320）； 13C NMR （100 MHz， CD3OD） δ： 40.5 （Cl）， 21.2 （C2）， 39.4 （C3）， 45.2 （C4）， 56.6 （C5）， 27.6 （C6）， 39.6 （C7）， 149.6 （C8）， 57.5 （C9）， 41.5 （Cl0）， 23.1 （C11）， 39.9 （C12）， 140.1 （C13）， 124.8 （C14）， 59.4 （C15）， 16.4 （C16）， 106.9 （C17）， 29.7 （C18）， 181.3 （C19）， 13.5 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Su et al （1994）報(bào)道一致，故鑒定化合物5為isocupressic acid。

化合物6白色針晶。 ESIMS m/z： 317 [MH]—； 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 4.41 （1H， m， H12）， 6.33 （1H， dd， J=17.8， 11.1 Hz， H14）， 5.12 （1H， d， J = 11.1 Hz， H15a）， 5.41 （1H， d， J=17.8 Hz， H15b）， 5.14 （1H， br s， H16a）， 5.21 （1H， br s， H16b）， 4.52 （1H， br s， H17a）， 4.88 （1H， br s， H17b）， 1.24 （3H， s， CH318）， 0.57 （3H， s， CH320）； 13C NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 38.7 （Cl）， 19.8 （C2）， 37.8 （C3）， 44.2 （C4）， 56.2 （C5）， 26.1 （C6）， 38.9 （C7）， 148.7 （C8）， 51.7 （C9）， 40.1 （Cl0）， 31.2 （C11）， 69.9 （C12）， 150.4 （C13）， 136.0 （C14）， 114.7 （C15）， 113.3 （C16）， 106.5 （C17）， 26.1 （C18）， 183.9 （C19）， 12.8 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Wu et al （2013）報(bào)道一致，故鑒定化合物6為fokihodgin F。

化合物7白色粉末。ESIMS m/z： 401 [M + K] +； 1H NMR （400 MHz， CD3OD） δ： 5.27 （1H， m， H14）， 4.58 （2H， m， H15a and H15b）， 1.69 （3H， s， CH316）， 4.52 （1H， br s， H17a）， 4.85 （1H， br s， H17b）， 1.34 （3H， s， CH318）， 0.62 （3H， s， CH320）， 2.14 （3H， s， OCOCH3）； 13C NMR （100 MHz， CD3OD） δ： 40.4 （Cl）， 21.2 （C2）， 39.3 （C3）， 45.1 （C4）， 56.4 （C5）， 27.5 （C6）， 39.3 （C7）， 149.5 （C8）， 57.5 （C9）， 41.4 （Cl0）， 22.9 （C11）， 39.9 （C12）， 143.8 （C13）， 119.8 （C14）， 62.3 （C15）， 16.5 （C16）， 106.9 （C17）， 29.6 （C18）， 181.1 （C19）， 13.5 （C20）， 21.2 （OCOCH3）， 172.8 （OCOCH3）。以上數(shù)據(jù)與Popova et al （2009）報(bào)道一致，故鑒定化合物7為acetylisocupressic acid。

化合物8無色油狀。 ESIMS m/z： 359 [M + Na] +； 1H NMR （400 MHz， CD3OD） δ： 5.43 （1H， t， J = 6.8 Hz， H14）， 4.14 （2H， d， J = 6.8 Hz， H15a and H15b）， 4.04 （2H， d， J = 8.4 Hz， H16a and H16b）， 4.59 （1H， br s， H17a）， 4.87 （1H， br s， H17b）， 1.20 （3H， s， CH318）， 0.64 （3H， s， CH320）； 13C NMR （1 00 MHz， CD3OD） δ： 39.9 （Cl）， 21.2 （C2）， 39.3 （C3）， 45.1 （C4）， 57.5 （C5）， 27.6 （C6）， 40.4 （C7）， 149.6 （C8）， 56.9 （C9）， 41.5 （Cl0）， 23.4 （C11）， 34.9 （C12）， 143.3 （C13）， 127.5 （C14）， 58.8 （C15）， 60.1 （C16）， 107.1 （C17）， 29.7 （C18）， 181.4 （C19）， 13.5 （C20）。以上數(shù)據(jù)與Ren & Ye （2006）報(bào)道一致，故鑒定化合物8為15，16dihydroxylabda8（17），13（E）dien19oic acid。

2.2 抗炎活性測(cè)試

利用LPS誘導(dǎo)刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，通過Griess法對(duì)上述8個(gè)化合物進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià)。除化合物1在25 μmol·L1的濃度下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性（圖2），其余化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO均具有不同程度的抑制作用， 其抑制率在11.50%～

3結(jié)論

采用色譜分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定方法，從采自云南昆明植物園翠柏中獲得8個(gè)二萜類化合物，均為首次從該植物中分離得到。NO作為炎癥組織損傷的重要致病因子，在急、慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)免疫細(xì)胞遭受微生物內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等刺激時(shí)，會(huì)生成大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS），產(chǎn)生NO進(jìn)行免疫應(yīng)答。因此，本研究通過各化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響來評(píng)價(jià)各化合物的抗炎活性。結(jié)果表明化合物2～8對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的釋放均具有不同程度的抑制作用，尤其是化合物7的抑制作用最強(qiáng)， 其IC50值為9.31 μmol·L1。本研究闡明了翠柏抗炎作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為翠柏的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

CHIANG YM， LIU HK， LO JM， et al， 2003. Cytotoxic constituents of the leaves of Calocedruds formosana [J]. J Chin Chem Soc， 50 （1）： 161-166

Editorial Committee of Flora of China， 1978. Flora of China [M]. Beijing： Science Press， 7： 325-327. [中國植物志編委會(huì)， 1978，中國植物志 [M]. 北京： 科學(xué)出版社， 7： 325-327.]

FANG JM， HSU KC， CHENG YS， 1989. Terpenoids from leaves of Calocedrus formosana [J]. Phytochemistry， 28 （4）： 1173-1175.

FELICIANO AS， MEDARDE M， LOPEZ JL， et al， 1988. Terpenoids from leaves of Juniperus thurifera [J]. Phytochemistry， 27（7）： 2241-2248.

FUKUSHIMA JI， YATAGAI M， OHIRA T， 2002. Abietanetype and labdanetype diterpenoids from the cones of Chamaecyparis obtusa [J]. J Wood Sci， 48 （4）： 326-330.

HSIEH CL， TSENG MH， KUO， YH， 2005. Formosadimers A， B， and C from the bark of Calocedrus macrolepis var. formosana [J]. Chem Pharm Bull， 53 （11）： 1463-1465.

HSIEH CL， TSENG MH， SHAO YY， et al， 2006. C35 terpenoids from the bark of Calocedrus macrolepis var. formosana with activity against human cancer cell lines [J]. J Nat Prod， 69 （11）： 1611-1613.

HSIEH CL， TSENG MH， PAN RN， et al， 2011. Labdanecaryophyllic acid， a novel cytotoxic C35 terpenoid from Calocedrus macrolepis var. formosana [J]. Tetrahedron Lett， 52 （4）： 515-517.

MOSMANN T， 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival： Application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. J Imm Methods， 65 （1）： 55-63.

POPOVA MP， CHINOU IB， MAREKOV IN， et al， 2009. Terpenes with antimicrobial activity from Cretan propolis [J]. Phytochemistry， 70 （10）： 1262-1271.

REED LJ， MUENCH H， 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints [J]. Am J Hyg， 27 （3）： 493-497.

REN XY， YE Y， 2006. Labdane diterpenes from the seeds of Platycladus orientalis [J]. J Asian Nat Prod Res， 8 （8）： 677-682.

SU WC， FANG JM， CHENG YS， 1994. Labdanes from Cryptomeria japonica [J]. Phytochemistry， 37 （4）： 1109-1114.

WANG L， WANG SY， WU XD， et al， 2013. Study on chemical compositions of Calocedrus macrolepis [J]. J Kumming Med Univ， 34 （7）： 8-11. [王蕾， 王雙燕， 吳興德， 等， 2013. 翠柏的化學(xué)成分研究 [J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 34 （7）： 8-11.]

WU XD， HE J， LI XY， et al， 2013. Diterpenoids from the twigs and leaves of Fokienia hodginsii [J]. J Nat Prod， 76（6）： 1032-1038.

WU XD， WANG SY， WANG L， et al， 2013. Labdane diterpenoids and lignans from Calocedrus macrolepis [J]. Fitoterapia， 85（1）： 154-160.

YANG XL， LIU D， BIAN K， et al， 2013. Study on in vitro antiinflammatory activity of total flavonoids from Glycyrrhizae radix et Rhizoma and its ingredients [J]. Chin J Chin Mat Med， 38（1）： 99-104. [楊曉露， 劉朵， 卞卡， 等， 2013. 甘草總黃酮及其成分體外抗炎活性及機(jī)制研究 [J]. 中國中藥雜志， 38（1）： 99-104.]