甘沛明 鄧曉華 招鈺娟 梁雪琪 黎小鵬

摘要 [目的]建立豬肉中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的同時(shí)分析方法。[方法]樣品經(jīng)過與HLB固相萃取小柱凈化、洗脫，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子模式進(jìn)行定性、定量分析。[結(jié)果]以豬肉為基質(zhì)，四環(huán)素類抗生素在加標(biāo)濃度為2和5 μg/kg時(shí)，回收率為75.7%～88.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～5.6%（n=3），方法檢出限為0.4～1.5 ng/mL；喹諾酮類抗生素在加標(biāo)濃度為2和5 μg/kg時(shí)，回收率為79.0%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～6.3%（n=3），方法檢出限為0.5～2.0 ng/mL。[結(jié)論]該試驗(yàn)所建立的方法可成功地應(yīng)用于豬肉中目標(biāo)抗生素殘留的分析。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；喹諾酮類；四環(huán)素類；抗生素

中圖分類號(hào) S851.34+7.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）06-0076-03

Simultaneous Determination of Quinolone and Tetracycline Antibiotics Residues in Pork by HPLC-MS/MS

GAN Pei-ming，DENG Xiao-hua，ZHAO Yu-juan et al （Zhongshan Quality Supervision & Inspection of Agricultural Products，Zhongshan，Guangdong 528400）

Abstract [Objective] To establish a method for simultaneous determination of quinolone and tetracycline antibiotics in pork.[Method] Using HLB cartridge for purification and elution，the qualitative and quantitative analysis was performed by HPLC-MS/MS MRM ion model.[Result] Using pork as substrate，the recoveries and relative standard deviations （RSD，n=3） were 75.7%-88.7%，1.2%-5.6% for tetracycline at 2 and 5 μg/kg spiking levels and 79.0%-90.5%，2.1%-6.3% for quinolone at 2 and 5 μg/kg spiking levels，respectively.The detection limits were 0.4-1.5 ng/mL for tetracycline and 0.5-2.0 ng/mL for quinolone.[Conclusion] The method can be successfully applied to the survey of antibiotics in pork.

Key words HPLC-MS/MS；Quinolone；Tetracycline；Antibiotics

隨著畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國抗生素的用量和種類也在日益增長。動(dòng)物性產(chǎn)品中抗生素的殘留不僅會(huì)引起食品安全問題，還會(huì)對(duì)環(huán)境帶來影響。大多數(shù)抗生素不能被動(dòng)物腸胃完全吸收，有50%～70%以母體或代謝物的形式排出動(dòng)物體外[1]，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的健康產(chǎn)生毒害，并通過食物鏈最終對(duì)人體的健康產(chǎn)生危害[2-7]。目前，畜禽食品中殘留抗生素對(duì)環(huán)境的污染和人類的危害已引起人們的高度重視。

為治療動(dòng)物疾病和提高動(dòng)物抗病能力，喹諾酮類和四環(huán)素類藥物被人們廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物飼養(yǎng)過程中，從而造成肉類中抗生素藥物的殘留。人類通過不同途徑攝入后都會(huì)在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致很多細(xì)菌產(chǎn)生了抗藥性，對(duì)人類的身體健康有相當(dāng)大的危害[8-10]。目前，食品安全監(jiān)督機(jī)構(gòu)以及相關(guān)企業(yè)將這2類藥物均列為日常檢測項(xiàng)目，進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控。

因此，筆者選擇常用的四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素為研究對(duì)象，采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)檢測，建立了動(dòng)物性食品中高靈敏度的同時(shí)分析方法，并將所建立的方法應(yīng)用于各種動(dòng)物性食品的四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。1200-6410高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子（ESI）源，美國Agilent公司；Milli Q 凈化系統(tǒng)，默克公司；氮吹儀，杭州雪中炭公司；1/100 000天平，梅特勒托利多公司；1/10天平，賽多利斯公司；勻漿機(jī)，IKA公司；固相萃取裝置，美國Agilent公司；冷凍離心機(jī)，希格瑪公司。

1.1.2 主要試劑。四環(huán)素、金霉素、土霉素，氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度均不低于90%；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸乙酯，默克公司；Plexa固相萃取柱（200 mg 6cc），美國Agilent公司；Mcllvaince-Na2EDTA緩沖液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑配制

分別準(zhǔn)確稱取3種四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品各5.000 0 mg，以甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻即得濃度為100 mg/L各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別準(zhǔn)確稱取4種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品各5.000 0 mg，以0.1%甲酸水+乙腈（1∶4）溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻即得濃度為100 mg/L各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取磷酸二氫鈉7.8 g，用水稀釋至1 000 mL。

0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液：取磷酸氫二鈉17.9 g，用水稀釋至1 000 mL。

磷酸鹽緩沖溶液：取0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液190 mL，用0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液稀釋至1 000 mL。

Mcllvaince-Na2EDTA緩沖液：分別取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉39.2 g，用900 mL水稀釋，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，誤差小于0.2，用水稀釋至1 000 mL。

洗脫液：取甲醇150 mL，加乙酸乙酯150 mL、濃氨水6 mL，混勻。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 液相色譜條件。

色譜柱為Agilent Poroshell EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相如表1所示；柱溫45 ℃；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件。

電離方式為ESI+，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣流量10 mL/min，干燥氣溫度350 ℃，霧化器壓力2.76×105Pa，定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量見表2。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取。

準(zhǔn)確稱取試料5 g于50 mL離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液8 mL，渦旋1 min后超聲20 min，10 000 r/min、4 ℃ 離心5 min，取上清液到另一50 mL離心管中，殘?jiān)昧姿猁}緩沖溶液8 mL重復(fù)提取1次，合并上清液，混勻備用。

1.4.2 凈化。HLB萃取柱依次用甲醇5 mL和水5 mL活化，取備用液過柱。依次用水5 mL、20%甲醇水溶液5 mL淋洗，抽干5 min用洗脫液10 mL洗脫，收集洗脫液，于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加入初始流?dòng)相1 mL渦旋1 min溶解殘留物。0.22 μm濾膜過濾，供測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

選用HLB固相萃取小柱吸附是保證高效萃取效率的基礎(chǔ)。該試驗(yàn)對(duì)比研究了C18萃取柱與HLB萃取柱對(duì)7種抗生素的富集效果。結(jié)果表明，HLB柱對(duì)7種抗生素具有較好的萃取效果，且重復(fù)性更好。因此確定HLB柱作為萃取柱。

2.2 工作曲線的線性范圍和方法的檢出限

在該試驗(yàn)條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在10、20、50、100、200、400 ng/mL各取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖得出各種獸藥線性方程、相關(guān)系數(shù)，以最低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品逐步稀釋，進(jìn)樣并分析S/N=3確定檢出限（LOD），結(jié)果見表3。

2.3 樣品的加標(biāo)回收率及相關(guān)系數(shù)

取豬肉基底，添加2和5 μg/kg，按“1.4”前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定3份，考察方法的回收率以及重現(xiàn)性。在分析前添加至樣品中，對(duì)分析過程進(jìn)行質(zhì)量控制。從表4可以看出，在各加標(biāo)水平上，豬肉中獸藥的加標(biāo)回收率在75.7%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.2%～6.3%。由此可見，所建立的方法有較好的重現(xiàn)性，回收率也完全符合要求。

3 結(jié)論

該研究采用SPE前處理法與LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)分析豬肉中的四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素殘留。樣品經(jīng)過HLB固相萃取小柱凈化、洗脫，建立了豬肉中四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素同時(shí)分析的高靈敏多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子模式進(jìn)行定性、定量分析的方法。該方法以豬肉為基質(zhì)做添加回收，豬肉中獸藥的加標(biāo)回收率在75.7%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.2%～6.3%。結(jié)果顯示，該前處理方法均符合國標(biāo)要求。該試驗(yàn)所建立的多殘留檢測方法大大地提高了工作效率，降低了分析成本，對(duì)動(dòng)物性食品的安全衛(wèi)生工作意義重大。

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