王濤 鄒玉 孫小英 王魁源 許龍 羅志文 呂冬云

摘要 [目的]優(yōu)化美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取方法，并研究美洲大蠊蛋白質(zhì)對小鼠傷口愈合的影響。[方法]采用堿提法、鹽提法和酶提法對美洲大蠊蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和提取，測定不同方法提取美洲大蠊蛋白質(zhì)的含量，優(yōu)化美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取工藝；并用提取的美洲大蠊蛋白質(zhì)進(jìn)行小鼠傷口愈合試驗，研究美洲大蠊蛋白質(zhì)對小鼠傷口愈合的影響。[結(jié)果]在堿濃度為1.5%、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高；在鹽濃度為1.0%、提取溫度為40 ℃、提取時間為2.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高；在酶占樣本比為0.6%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高。小鼠傷口愈合試驗表明，美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)傷口愈合，且愈合時間比正常情況下縮短近一半。[結(jié)論]堿液濃度、鹽濃度和酶濃度對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的影響最大。3種方法提取美洲大蠊蛋白質(zhì)的效果從大到小依次為酶提法、堿提法、鹽提法，即美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法為胰蛋白酶提取法。美洲大蠊蛋白質(zhì)對小鼠傷口愈合有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 美洲大蠊；蛋白質(zhì)；提取工藝；傷口愈合

中圖分類號 R282.74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0124-04

Optimization of Extraction Process of Periplaneta americana Protein and Its Effect on Wound Healing

WANG Tao， ZOU Yu， SUN Xiao-ying，L Dong-yun* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract [Objective] To optimize extraction method of Periplaneta americana protein and study its effect on wound healing of mice. [Method] The protein was seperated and extracted from P. americana by alkali extraction， salt extraction and enzyme extraction， protein content extracted by different methods were determined， the extraction techniques were optimized； effects of protein from P. americana on wound healing of mice were studied. [Result] The protein yield was highest under three conditions： alkali concentration 1.5%， extraction temperature 80 ℃， extraction time 1.0 h； salt concentration 1.0%， extraction temperature 40 ℃， extraction time 2.0 h； proportion of enzyme 0.6%， enzymolysis temperature 45 ℃， enzymolysis time 2.0 h. Protein from P. americana could promote mice wound healing， and healing time was shortened by nearly half. [Conclusion] Alkali liquor concentration， salt concentration and enzyme concentration have greatest impact on protein extraction. The order of extraction effect is enzyme extraction， alkali extraction， salt extraction， namely the optimal method for extracting protein from P. americana is trypsin extraction. Protein from P. americana can promote mice wound healing.

Key words Periplaneta americana；Protein；Extraction process；Wound healing

美洲大蠊（Periplaneta americana）是昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”等。美洲大蠊最早的藥用價值出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，用于治血痰癥、寒熱、破積聚、喉咽痹、內(nèi)寒無子[1]。在20世紀(jì)70年代，國內(nèi)以美洲大蠊為材料就已經(jīng)研制出了“康復(fù)新液”，主要治療軍隊的槍傷，現(xiàn)在已經(jīng)普及[2]。目前，國內(nèi)對美洲大蠊的研究主要集中在各種蜚蠊的種群調(diào)查、分布、生長規(guī)律及侵害程度方面，防治及蜚蠊抗性方面，生長繁殖及各種殺滅劑對其的殺滅效率比較與殺滅機理的研究，其基因表達(dá)及致敏作用方面的研究，藥用價值開發(fā)的研究等[3-4]。國外主要進(jìn)行美洲大蠊形態(tài)結(jié)構(gòu)以及病蟲害防治的研究，醫(yī)學(xué)方面主要進(jìn)行消化道和神經(jīng)沖動的研究，而有關(guān)美洲大蠊體內(nèi)提取蛋白質(zhì)方面的研究較少。

昆蟲蛋白是當(dāng)代一種具有巨大發(fā)展前景的蛋白質(zhì)資源庫，而且昆蟲資源豐富，昆蟲蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)價值也非常高，適合人類去開發(fā)利用。昆蟲蛋白可以在食品、醫(yī)藥等各個方面發(fā)揮出巨大的作用[5-13]，昆蟲蛋白系列食品已開始大規(guī)模工廠化生產(chǎn)[14-15]。筆者以美洲大蠊為試驗原料，采用堿提法、鹽提法和酶提法對美洲大蠊蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和提取，測定不同方法提取美洲大蠊蛋白質(zhì)的含量，優(yōu)化美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取工藝；并用提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行小鼠傷口愈合試驗，研究美洲大蠊蛋白質(zhì)對小鼠傷口愈合的影響，以期為推動醫(yī)療和保健事業(yè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。美洲大蠊購于河北安國藥材大市場，經(jīng)佳木斯大學(xué)羅志文副教授鑒定為蜚蠊科美洲大蠊（Periplaneta americana），藥材標(biāo)本現(xiàn)保存于佳木斯大學(xué)生物標(biāo)本館。

1.1.2

儀器。中藥粉碎機、40目分樣篩、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、循環(huán)水多用真空泵、低速離心機、酸度計、恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、冰箱、抽濾瓶、燒杯、移液管、洗耳球、膠頭滴管、容量瓶、透析袋。

1.1.3

試劑。蒸餾水、石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、胰蛋白酶、鹽酸。

1.2 方法

1.2.1

試驗材料預(yù)處理。美洲大蠊經(jīng)50 ℃烘干后，用粉碎機粉碎，過40目篩，保存?zhèn)溆?。采用原?石油醚=1/3（W/V）處理，除去脂溶性雜質(zhì)，室溫浸泡12～24 h，經(jīng)過濃縮后回收石油醚。重復(fù)3次，采用60 ℃烘干后備用。

1.2.2 美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)化。

1.2.2.1 堿提取法。

（1）試驗設(shè)計。選取堿液濃度（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）作為因素，每個因素3種梯度處理。采用L27（33）設(shè)計正交試驗（表1），3次重復(fù)取平均值。測定某因素時，其他因素作非測定因素。

（2）提取方法。精確稱取20 g美洲大蠊干粉樣本，加入100 mL NaOH溶液，用玻璃棒攪拌均勻。經(jīng)過一定的提取時間、一定的提取溫度，再經(jīng)過4 000 r/min離心去除蟲渣。用10% HCl調(diào)節(jié)pH至4.5左右，可見明顯的沉淀析出，再經(jīng)過4 000 r/min離心4 min后得到粗鹽蛋白。最后將鹽蛋白裝入透析袋內(nèi)透析24 h得到去鹽蛋白。去鹽蛋白再烘干至恒重。

1.2.2.2 鹽提取法。

（1）試驗設(shè)計。選取鹽液濃度（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）作為因素，每個因素3種梯度處理。采用L27（33）設(shè)計正交試驗（表2），3次重復(fù)取平均值。測定某因素時，其他因素作非測定因素。

（2）提取方法。精確稱取20 g美洲大蠊干粉樣本，加入100 mL NaCl溶液，用玻璃棒攪拌均勻。經(jīng)過一定的提取時間、一定的提取溫度，再經(jīng)過4 000 r/min離心去除蟲渣。用10% HCl調(diào)節(jié)pH至4.5左右，可見明顯的沉淀析出，再經(jīng)過4 000 r/min離心4 min后得到粗鹽蛋白。最后將鹽蛋白裝入透析袋內(nèi)透析24 h得到去鹽蛋白，去鹽蛋白再烘干至恒重。

1.2.2.3 胰蛋白酶提取法。

（1）試驗設(shè)計。選取酶占樣本比例（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）作為因素，每個因素3種梯度處理。采用L27（33）設(shè)計正交試驗（表3），3次重復(fù)取平均值。測定某因素時，其他因素作非測定因素。

（2）提取方法。精確稱取20 g美洲大蠊干粉樣本，加入適量胰蛋白酶和100 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻。經(jīng)過一定的提取時間、一定的提取溫度。然后將溫度升至80 ℃殺滅胰蛋白酶，冷卻后將蟲渣過濾，烘干后得到酶提法的粗蛋白。最后將粗蛋白裝入透析袋內(nèi)透析24 h后烘干至恒重。

1.2.3 小鼠傷口愈合試驗。

1.2.3.1

試驗材料。美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)（4 ℃冰箱保存），雌雄小鼠各10只，鼠籠，解剖器材，酒精棉，消毒紗布。

1.2.3.2

試驗方法。取雌雄各10只小鼠，隨機分成2組，每組10只，第1組為試驗組，編號A1～A10，第2組為對照組，編號B1～B10。分別將每只小鼠背部的毛去掉，然后在每只小鼠背部相同位進(jìn)行受傷處理，傷口均為1 cm2。將試驗組受傷小鼠的傷口用酒精棉消毒，然后用美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)涂抹在傷口處，每天更換1次藥物；對照組受傷小鼠的傷口消毒后不進(jìn)行任何藥物處理。用消毒紗布將2組小鼠的傷口包扎好，生長環(huán)境相同，喂食量相同。每天記錄1次傷口愈合情況并進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 堿提取法。從表4可以看出，堿液濃度、提取溫度和提取時間對美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取率均有影響。在測定堿液濃度（其他因素不變）時，堿液濃度在1.5%時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定提取溫度（其他因素不變）時，提取溫度為80 ℃時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定提取時間（其他因素不變）時，提取時間為1.0 h時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大。方差分析表明，堿液濃度對美洲大鐮蛋白質(zhì)提取率的影響最大，其次是提取時間，提取溫度的影響最小，即不同試驗因素對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率影響的順序從大到小依次為A、C、B。綜上所述，確定堿提取法對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的最佳工藝方案為A3B3C2，即堿濃度為1.5%、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.0 h。

2.1.2 鹽提取法。從表5可以看出，鹽液濃度、提取溫度和提取時間對美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取率均有影響。在測定鹽液濃度（其他因素不變）時，鹽液濃度在1.0%時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定提取溫度（其他因素不變）時，提取溫度為40 ℃時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定提取時間（其他因素不變）時，提取時間為2.0 h時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大。方差分析表明，鹽液濃度對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率的影響最大，其次是提取溫度，提取時間的影響最小，即不同試驗因素對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率影響的順序從大到小依次為A、B、C。綜上所述，確定鹽提取法對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的最佳工藝方案為A2B1C2，即鹽濃度為1.0%、提取溫度為40 ℃、提取時間為2.0 h。

2.1.3 胰蛋白酶提取法。從表6可以看出，酶占樣本比、酶解溫度和酶解時間對美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取率均有影響。在測定酶占樣本比例（其他因素不變）時，酶占樣本比例在0.6%時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定酶解溫度（其他因素不變）時，酶解溫度為45 ℃時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大；在測定酶解時間（其他因素不變）時，酶解時間為2.0 h時美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最大。方差分析表明，酶占樣本比例對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率的影響最大，其次是酶解溫度，酶解時間的影響最小，即不同試驗因素對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率影響的順序從大到小依次為A、B、C。綜上所述，確定胰蛋白酶提取法對美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的最佳工藝方案為A3B2C1，即酶占樣本比例為0.6%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2.0 h。

2.2 小鼠傷口愈合試驗

從試驗組小鼠和對照組小鼠傷口愈合過程中傷口直徑大?。ū?～8）可以看出，試驗組小鼠，即由美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行換藥試驗的小鼠傷口愈合得更快；小鼠在受傷后第7天傷口已經(jīng)開始愈合，在第10天基本全部愈合。而對照組小鼠在受傷后的第13天傷口開始愈合，在第17天才全部愈合。對照組小鼠傷口愈合時間基本是試驗組小鼠系傷口愈合時間的2倍。綜上所述，美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)傷口愈合，可以比傷口在正常情況下愈合縮短近一半的時間。

3 結(jié)論

采用不同的提取方法進(jìn)行美洲大蠊的蛋白質(zhì)提取純化試驗，并且使用提取的美洲大蠊蛋白進(jìn)行小鼠傷口愈合試驗，以獲得具有生物活性的昆蟲蛋白。結(jié)果表明，在堿濃度為1.5%、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高；在鹽濃度為1.0%、提取溫度為40 ℃、提取時間為2.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高；在酶占樣本比例為0.6%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2.0 h時，美洲大蠊蛋白質(zhì)提取率最高。而且用胰蛋白酶提取法提取美洲大蠊蛋白質(zhì)的提取率均在35.00%以上，最高可達(dá)58.87%，所以3種方法提取美洲大蠊蛋白質(zhì)的效果從大到小依次為酶提法、堿提法、鹽提法，即美洲大蠊蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法為胰蛋白酶提取法，并且在酶占樣本比例為0.6%、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為2.0 h時最高提取率為58.87%。由試驗組（即用美洲大蠊蛋白質(zhì)進(jìn)行換藥試驗）的小鼠與對照組小鼠傷口愈合情況可以看出，美洲大蠊提取的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)傷口愈合，且愈合時間比正常情況下縮短近一半。該研究為進(jìn)一步從昆蟲中開發(fā)高效的昆蟲蛋白類藥物、食品和保健品等提供基礎(chǔ)，對昆蟲蛋白的開發(fā)利用起到良好的推廣作用。

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