魏歡 楊建文 顏小捷 盧鳳來

摘要 [目的]測定核桃青皮80%乙醇提取物及其經(jīng)大孔樹脂HP-20分段后的各純化部分的總酚含量，評價其各部分的抗氧化能力，并分析總酚含量與抗氧化能力的關(guān)系。[方法]采用福林-酚比色法，測定總酚含量，通過DPPH·和ABTS·自由基清除法評價其抗氧化能力。[結(jié)果]核桃青皮提取物及其各純化部分均表現(xiàn)出一定的抗氧化性，其中Fr.2（20%甲醇洗脫部分）、Fr.3（40%甲醇洗脫部分）部分的IC50 （半數(shù)抑制濃度）均高于VC （抗壞血酸），F(xiàn)r.4 （60%甲醇洗脫部分）和Ext.（80%乙醇提物部分）與VC相當(dāng)，并且總酚含量和抗氧化能力呈正相關(guān)。[結(jié)論]經(jīng)過大孔樹脂HP-20處理后的核桃青皮乙醇提取物，其總酚的含量得到了富集，為進一步研究核桃青皮各部分的物質(zhì)成分提供了依據(jù)。同時表明核桃青皮的提取物可以作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品、保健品等行業(yè)。

關(guān)鍵詞 核桃青皮；總酚；含量測定；抗氧化

中圖分類號 S664.1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0121-03

Determination of Total Phenols Content and Antioxidant Capacity of Walnut Green Husks

WEI Huan1，2，YANG Jian-wen1*，YAN Xiao-jie2 et al （1.Guilin University of Technology，Guilin，Guangxi 541006； 2.Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，Guilin，Guangxi 541006）

Abstract [Objective]To determine the content of total phenols in the 80% ethanol extracts of walnut green husk and its several purification sections isolated and purified by HP-20，evaluate the antioxidant capacity of the extracts，and analyze the relationship between the content of polyphenols and antioxidant capacity.[Method]The content of total phenolswere determined by the method of Folin-phenol，and its extract antioxidant capacities were compared by DPPH· and ABTS· radical scavenging.[Result]All the extracts showed antioxidant activity，in which the IC50（half maximal inhibitory concentration） value of Fr.2（the elution fraction of 20% methanol ） and Fr.3（the elution fraction of 40% methanol） was better than that of VC（ascorbic acid），F(xiàn)r.4（the elution fraction of 60% methanol ） and Ext.（the extract portion of 80% ethanol） was similar to VC，and polyphenol content and antioxidant capacity was positive correlation.[Conclusion]The content of polyphenols in the ethanol extract of walnut green husk can be enriched by HP-20，which will provide a basis for the further study of the material composition of the walnut green husk.The extract of walnut green husk can be used as a natural antioxidant used in food，health care，cosmetics，health products and other industries.

Key words Walnut green husk；Total phenols；Content detemination；Antioxidant

核桃青皮又稱青龍衣，為核桃未成熟季節(jié)其外部的一層厚厚的綠色果皮，味辛、苦，性澀、平。核桃成熟期間，大量青皮作為垃圾堆放于田間、地頭或溝邊，造成環(huán)境污染。如果對核桃青皮中的有效物質(zhì)加以綜合利用，不僅可以保護環(huán)境，還可以增加果農(nóng)收入[1]。核桃青皮具有抑菌、殺蟲、解毒、抗腫瘤功效[2]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對核桃青皮化學(xué)成分進行了研究，從中提取分離鑒定所得化合物，主要有黃酮、萘醌、二芳基庚烷、萜、甾體、多酚、脂肪酸及多糖等多類化合物[3-6]。多酚是多羥基分類的總稱，在核桃青皮中的含量僅次于黃酮、蒽醌類，具有很強的抑菌、抗氧化性、抗腫瘤、抗衰老等功效，其抗癌機理也與其抗氧化性息息相關(guān)[7]。多酚的測量方法常見的有分光光度法、薄層層析法、高錳酸鉀滴定法、福林-酚（Folin-Ciocalteu）比色法、香草醛鹽酸法、氣液色譜法、比色法等，其中Folin-Ciocalteu比色法操作簡單、化學(xué)干擾少、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性高，靈敏度和選擇性高，應(yīng)用也最為廣泛[8]。然而對于如何提高核桃青皮中總酚的提取率和測定總酚的含量，及總酚含量與抗氧化性的關(guān)系等缺乏系統(tǒng)的研究。大孔吸附樹脂是一種常用的分離純化多酚物質(zhì)的方法，由于該技術(shù)成本低廉、選擇性好、效率高、毒性小等優(yōu)點而具備很好的應(yīng)用前景[9-10]。筆者通過大孔吸附樹脂HP-20對核桃青皮粗提物進行預(yù)處理，建立一個測定核桃青皮中總酚含量的方法，并測定核桃青皮粗提物和各純化部分對DPPH·和ABTS·自由基的清除能力，評價其抗氧化能力[11]，以期為有效開發(fā)利用核桃青皮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。JA2003N 電子天平（上海菁海儀器有限公司）；電子天平XS225A -SCS（Precisa）； FN101-2A 鼓風(fēng)干燥箱（長沙儀器儀表廠）；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BuchiLabortechnik AG CH-9230） ；SHZ - D（Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市英予華儀器廠）；HH- S型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.1.2 試劑。

無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司，批號110601） ；無水碳酸鈉（AR，廣州化學(xué)試劑廠，批號830902）；沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所）；福林酚試劑（GOLDWHEAT）；純凈水；其他試劑均為分析純。2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，美國Sigma公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma 公司）；抗壞血酸（VC，中國藥品生物制品檢定所）。

1.1.3 樣品。

新鮮的核桃青皮于2015年8月購買于廣西壯族自治區(qū)河池市鳳山縣。用80%乙醇浸泡提取7 d，連續(xù)提取3次。憑證標(biāo)本保存于廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 總酚含量測定方法。有關(guān)對照品溶液的配置以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立見參考文獻[12-14]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用稍加改進的Folin-Ciocalteu比色法測定其總酚的含量。Folin-Ciocalteu 比色法的原理是Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將試樣品中的總酚化合物定量氧化，同時自身被還原呈現(xiàn)藍色并生成藍色化合物，顏色的深淺與試樣樣品中總酚含量關(guān)系密切，以標(biāo)準(zhǔn)品為對照建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定不同樣品反應(yīng)后的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到被測樣品的總酚含量。此方法多用于食品或植物中多酚類物質(zhì)的測定。

1.2.2 供試樣品溶液的配制。

核桃青皮80%乙醇提取物干浸膏300 g，經(jīng)HP-20大孔樹脂處理，依次用水以及20%、40%、60%、80%、100%甲醇洗脫（各梯度均洗脫到無色為止）濃縮干燥，得到各純化部分。分別精密稱取Fr.1（水洗部分）、Fr.2（20%甲醇洗脫部分）、Fr.3（40%甲醇洗脫部分）、Fr.4（60%甲醇洗脫部分）、Fr.5（80%甲醇洗脫部分）、Fr.6（100%甲醇洗脫部分）干浸膏、Ext.（核桃青皮80%乙醇粗提物）20 mg，各加入50%乙醇溶解超聲，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容到刻度，搖勻，備用。分別精確吸取上述供試樣品0.1 mL，按“1.2.1”顯色方法顯色，測得各部分樣品吸光度。

1.2.3 對照品VC溶液的配制。具體方法同“1.2.2”。

1.2.4 抗氧化能力測定。測定方法參考[15-17]，稍作改動。

1.2.4.1 DPPH·自由基清除能力。

在同樣的濃度條件下，經(jīng)過DPPH·自由基檢測，吸光度越小說明樣品的清除能力越強，采用80%乙醇溶液分別配制提取物及各部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.00、1.50 mg/mL）。精密移去0.5 mL的樣品溶液于PE試管中，再加入0.5 mL DPPH·乙醇溶液（0.394 g/L）混勻（空白組用溶劑代替樣品溶液，對照組用溶劑代替DPPH·溶液），在37 ℃下避光水浴反應(yīng)30 min，在室溫條件下測定517 nm 的吸光度。按照以上相同的方法以抗壞血酸（VC）作陽性對照，按照以下公式計算DPPH·清除率，并計算提取物及各部分樣品的半清除率質(zhì)量濃度（IC50）。

DPPH·清除率=[A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%式中，A空白為0.5 mL DPPH·溶液與0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液的吸光度，A對照為0.5 mL樣品溶液和0.5 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

1.2.4.2 ABTS·自由基清除能力。

采用80%乙醇溶液分別配制提取物及各部分一系列不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0、12.5、25.0、37.5、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0 μg/mL），精密移取0.2 mL樣品溶液，再加入1 mL ABTS·溶液，混勻（空白組用溶劑代替樣品溶液，對照組用溶劑代替ABTS·溶液），在室溫下避光反應(yīng)30 min，測定734 nm下的吸光度。按照以上相同的方法以抗壞血酸（VC）作陽性對照，按照以下公式計算ABTS·清除率，并計算提取物及各部分樣品的半清除率質(zhì)量濃度（IC50）。

ABTS·清除率=[A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%式中，A空白為1.0 mL ABTS·溶液與0.2 mL 80%乙醇溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液的吸光度，A對照為0.2 mL樣品溶液和1.0 mL 80%乙醇溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮中總酚含量的測定

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=14.339 0x+0.003 7（R2=0.999 4），表明沒食子酸在0～0.036 mg范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系（圖1）。

方法學(xué)考察顯示，精密度試驗中計算得到的RSD為0.047%，說明該儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中計算得到的RSD為0.18%，表明該樣品在顯色后210 min內(nèi)穩(wěn)定性良好；重現(xiàn)性試驗中計算得到的RSD為0.56%，表明該方法重現(xiàn)性良好；加樣回收率試驗中，得到樣品的平均回收率為99.46%，RSD為0.96%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。

2.1.2 核桃青皮的總提取物及各純化部分的總酚含量測定。由表1可知，經(jīng)過HP-20大孔樹脂對核桃青皮提取物干浸膏樣品進行預(yù)處理，單從其得率來看，效果較好，總回收率達到95.46%。預(yù)處理所得的樣品中，總酚含量從高到低依次為Fr.3、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1。說明經(jīng)過大孔樹脂HP-20預(yù)處理后，核桃青皮中多酚類物質(zhì)得到了很好的富集。

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 DPPH·自由基清除能力。

由表1～2可知，在同一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品的總酚含量與DPPH·清除能力具有明顯的量效關(guān)系。提取物及各部分樣品對DPPH·的清除能力從大到小依次為Fr.3、Fr.2、Fr.4、VC、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1，F(xiàn)r.3、Fr.2、Fr.4的清除能力強于對照VC，F(xiàn)r.5的清除能力與VC相當(dāng)，F(xiàn)r.6和Fr.1的清除能力比VC弱。

2.2.2 ABTS·自由基清除能力。由表1～2可知，在同一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品的總酚含量與ABTS·清除能力具有很明顯的量效關(guān)系。提取物及各部分樣品對ABTS·自由基的清除能力從大到小依次為Fr.3、Fr.2、VC、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1，F(xiàn)r.3、Fr.2的清除能力比VC強，F(xiàn)r.4、Fr.5的清除能力與VC相當(dāng)，而Fr.1和Fr.6的清除能力比VC弱。

3 結(jié)論

福林-酚比色法具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，可用于測定核桃青皮和各部分總酚含量。經(jīng)過HP-20大孔樹脂對核桃青皮提取物干浸膏樣品進行預(yù)處理，單從其得率來看，效果較好，總回收率達95.46%。預(yù)處理所得的樣品中，總酚含量從高到低依次為Fr.3、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Ext.、Fr.6、Fr.1。說明經(jīng)過大孔樹脂HP-20預(yù)處理后，核桃青皮中多酚類物質(zhì)得到了很好的富集，通過DPPH·和ABTS·自由基清除試驗表明核桃青皮粗提物及其各純化部分均具有一定的抗氧化能力，而且經(jīng)過大孔樹脂HP-20的預(yù)處理后，F(xiàn)r.2、Fr.3和Fr.4部分的抗氧化能力明顯增強，甚至超過VC的抗氧化能力。試驗結(jié)果表明，核桃青皮粗提物與各純化部分的抗氧化能力與其總酚的含量呈正相關(guān)。該研究可以為進一步開發(fā)利用核桃資源以及其抑菌、殺蟲、抗氧化、抗腫瘤等生物方面的活性研究提供依據(jù)，也為更進一步深入研究核桃青皮中活性成分的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定提供理論基礎(chǔ)。

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