姚楠， 陳能， 許學(xué)猛， 黃雪君， 蔡大可， 劉文剛

（1廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院／廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510095；2廣東省第二中醫(yī)院 骨科，廣東 廣州510095；3廣州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣東 廣州510405）

補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的人原代軟骨細(xì)胞的影響

姚楠1， 陳能2,3， 許學(xué)猛2， 黃雪君1， 蔡大可1， 劉文剛2

（1廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院／廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510095；2廣東省第二中醫(yī)院 骨科，廣東 廣州510095；3廣州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣東 廣州510405）

目的 研究補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的人原代軟骨細(xì)胞的影響。方法 采用IL－1β（10 ng／mL）刺激人原代軟骨細(xì)胞，并且加入不同濃度的補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清處理24 h。然后用格式試劑法和酶聯(lián)免疫法分別檢測軟骨細(xì)胞上清液中NO和PGE2水平，采用RT－qPCR檢測軟骨細(xì)胞COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13、TIMP－1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清可明顯降低軟骨細(xì)胞NO和PGE2水平，并顯著降低COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13 mRNA表達(dá)，而對TIMP－1 mRNA表達(dá)無明顯影響。結(jié)論 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的人原代軟骨細(xì)胞有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13 mRNA表達(dá)有關(guān)。

補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清；白介素-1β；軟骨細(xì)胞

膝骨關(guān)節(jié)炎 （knee osteoarthritis，KOA）是全球范圍內(nèi)最常見的與老齡化相關(guān)的退行性關(guān)節(jié)病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給其家庭及社會均帶來沉重的負(fù)擔(dān)。骨關(guān)節(jié)炎在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于 “痹證”、 “骨痹” 的范疇。 中醫(yī)理論認(rèn)為，KOA的病機(jī)特點(diǎn)包括 “腎虛血瘀”、 “腎虛絡(luò)阻”等，并且絕經(jīng)后婦女的中醫(yī)辨證多屬 “腎虛”， “補(bǔ)腎活血法”成為了中醫(yī)治療該病的大法。本課題組許學(xué)猛教授在中醫(yī)整體觀和辨證論治的觀點(diǎn)指導(dǎo)下提出治療KOA的主要原則是補(bǔ)腎活血、活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕，進(jìn)而根據(jù)該原則篩選中藥組成補(bǔ)腎活血膠囊 （后更名為補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊）。方中選用杜仲、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)進(jìn)行補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，熟地滋陰補(bǔ)腎，這四藥共為君藥，血竭活血通絡(luò)為臣藥，另外以全蝎祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛為佐藥，六藥合用有強(qiáng)筋壯骨、活血通絡(luò)之功。該方為院內(nèi)制劑，目前已通過臨床試驗(yàn)以及分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該方對膝骨關(guān)節(jié)炎具有良性干預(yù)作用［1-2］，但其在細(xì)胞水平上的調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用IL－1β誘導(dǎo)退變的軟骨細(xì)胞，研究補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對IL－1β刺激的軟骨細(xì)胞NO和PGE2含量，以及對COX－2、iNOS、MMP－1、MMP－13和TIMP－1 mRNA表達(dá)的影響，從分子水平探討其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器電子分析天平 （德國Sartorius公司）；5424型小型高速離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）；-80℃ 超低溫冰箱 （美國Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀 （美國Bio-Rad公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀 （美國 Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級純水儀 （美國Millipore公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市富華儀器有限公司）；Varioskan Flash型全波長多功能酶標(biāo)儀 （美國Thermo公司）；ClassⅡType B2型生物安全柜 （新加坡Esco公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司）；Cellometer Mini自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 （美國Nexcelom公司）；DMI8倒置熒光顯微鏡 （德國Leica公司）。

1.2 藥物和試劑補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和DPBS（美國Gib co公司）；總RNA提取試劑Trigol（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo公司）；MaximaTMSYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×） （美國Thermo公司）；特異性引物 （上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；NO檢測試劑盒 （碧云天生物技術(shù)有限公司）；人PGE2ELISA試劑盒 （美國R＆D公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清制備取SPF級 SD雌性大鼠15只，其中 10只為給藥組，分別按高、低劑量 （0.486 g生藥／kg、0.243 g生藥／kg）各灌胃5只；5只為正常對照組，不給藥，用等體積生理鹽水灌胃。所有大鼠連續(xù)灌胃7 d，最后1次給藥后1 h，大鼠腹主動脈取血，3 000 rpm離心5 min，取上清液，56℃、30 min滅活，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾除菌，分裝，-80℃保存?zhèn)溆?，即為空白血清及高、低兩種濃度的含藥血清。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和造模選取本單位骨科手術(shù)室行膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的絕經(jīng)后女性患者（年齡＞65歲）的軟骨，迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室，在超凈工作臺用眼科剪切取軟骨組織，越細(xì)越好，至6 mm3大小的碎塊，放入培養(yǎng)皿，加 DPBS溶液清洗 2次，5 min／次，除去上清后加入0.25%胰酶消化30 min，然后吸棄上清液，加入0.02%Ⅱ型膠原酶于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化過夜。消化后將細(xì)胞懸液用 100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 rpm離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察生長情況，每2天換液1次，待軟骨細(xì)胞鋪滿瓶底后，用0.25%胰酶進(jìn)行消化和傳代，傳代后繼續(xù)用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞作為體外KOA模型。將培養(yǎng)的第二代的人軟骨細(xì)胞按每孔 3×105個(gè)細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用DPBS洗2次后，分為四組：正常對照組只添加細(xì)胞培養(yǎng)液 （高糖DMEM培養(yǎng)基＋10%大鼠空白血清）；模型對照組添加細(xì)胞培養(yǎng)液 （高糖DMEM培養(yǎng)基 ＋10%大鼠空白血清），并加入10 ng／mL IL-1β；含藥血清高、低劑量組：添加細(xì)胞培養(yǎng)液 （DMEM培養(yǎng)基＋10%大鼠高或低濃度含藥血清），并加入10 ng／mL IL-1β。以上各組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞以及上清液。

2.3 細(xì)胞上清液NO和PGE2的檢測根據(jù)試劑盒說明書要求，分別檢測細(xì)胞上清液的NO和PGE2含量。

2.4 基因表達(dá)的檢測首先采用Trigol、氯仿和異丙醇等試劑提取軟骨細(xì)胞總 RNA，然后采用 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，其中加入上述提取的總RNA，合成First-strand cDNA。引物設(shè)計(jì)利用Primer 6.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物信息如表1所示。

表1 擴(kuò)增的基因引物信息

將9.5 μL滅菌超純水、1 μL cDNA、特異性引物 F和 R（終濃度均是1 μM）各1 μL、MaximaTMSYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 μL混合后共25 μL放入定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。步驟如下：①94℃，5 min；②94℃，30 s；55℃，40 s；72℃，50 s（45個(gè)循環(huán)）；③72℃，7 min。反應(yīng)結(jié)束后，記錄Ct值，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算各組基因相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件，所有結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時(shí)采用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞NO和PGE2含量的影響模型對照組軟骨細(xì)胞上清液中NO和PGE2含量明顯高于正常對照組 （P＜0.01）；與模型對照組比較，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清高、低劑量均能顯著降低軟骨細(xì)胞上清液中NO和PGE2含量 （P＜0.05）。見表2。

表2 各組軟骨細(xì)胞NO和PGE2的含量比較 （±s）

表2 各組軟骨細(xì)胞NO和PGE2的含量比較 （±s）

注：與模型對照組比較，＆P＜0.01，*P＜0.05；與正常對照組比較，＃P＜0.01。

組別 n NO（μmol／L） PGE2（pg／mL）含藥血清高劑量組 3 6.27±0.40＆ 272.46±7.92＆含藥血清低劑量組 3 8.13±0.88* 305.38±8.18＆模型對照組 3 12.06±1.96＃ 330.71±12.95＃正常對照組 3 1.28±0.21 70.46±8.44

3.2 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對軟骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響與正常對照組比較，模型對照組軟骨細(xì)胞的COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)均明顯升高 （P＜0.05），而TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低 （P＜0.05）；與模型對照組比較，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清高和低劑量均顯著降低了COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá) （P＜0.05），但對TIMP-1 mRNA表達(dá)無明顯影響 （P＞0.05）。見表3。

表3 各組軟骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較 （±s）

表3 各組軟骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較 （±s）

注：與模型對照組比較，＆P＜0.01，*P＜0.05；與正常對照組比較，＃P＜0.01。

基因 n 含藥血清 含藥血清 模型對照組 正常對照組高劑量組 低劑量組COX-2 3 6.81±0.83＆ 7.92±0.91* 10.48±1.53＃ 1.00±0.24 iNOS 3 4.88±0.42＆ 5.43±0.70* 6.23±1.45＃ 1.00±0.27 MMP-1 3 3.90±0.52* 4.30±0.45* 5.44±0.69＃ 1.00±0.48 MMP-13 3 3.73±0.48＆ 5.57±0.86* 9.41±1.67＃ 1.00±0.49 TIMP-1 3 0.67±0.06 0.68±0.08 0.62±0.18＃ 1.00±0.30

4 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎 （KOA）自發(fā)病早期開始，其病理變化主要為關(guān)節(jié)組織的炎癥伴隨不同程度的退變，在這個(gè)過程中，有許多炎性細(xì)胞因子的參與，其中IL-1是炎性致病機(jī)制的決定因子之一［3］，它主要通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP）的合成和一氧化氮 （NO）的釋放，參與關(guān)節(jié)軟骨的退變降解過程。而阻斷IL-1β的產(chǎn)生則能夠快速且持續(xù)地降低大部分自身炎性疾?。?］的嚴(yán)重程度。

一方面，MMP家族在KOA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用，其中MMP-1和MMP-13是MMP家族中非常重要的兩種酶，它們在很大程度上對膠原蛋白的降解產(chǎn)生影響［5-6］。而基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 （TIMP）能夠抑制MMP酶活性，調(diào)節(jié)MMP酶發(fā)揮正常的功能，兩者共同維護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)MMP與TIMPs之間的平衡被打破后，就會引發(fā)KOA。另一方面，氧化應(yīng)激也是導(dǎo)致KOA發(fā)生和發(fā)展的重要原因。IL-1β能夠刺激iNOS和COX-2的表達(dá)，分別增加NO和PGE2的含量［7-10］，最終導(dǎo)致MMPs的表達(dá)上調(diào)［11-12］，進(jìn)而MMP與TIMPs之間的平衡被打破，最終誘發(fā)和加重KOA。

關(guān)于補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊組方中所含的單味中藥，王勝楠［13］的研究發(fā)現(xiàn)，杜仲苷可抑制IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞分泌iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13。王毅等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，含骨碎補(bǔ)的藥物血清可降低IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞MMP-3／TIMP-1水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對照組比較，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清能夠明顯降低IL-1β刺激下軟骨細(xì)胞上清液中NO和PGE2的含量 （P＜0.05），并且降低軟骨細(xì)胞COX-2、iNOS、MMP-1和MMP-13 mRNA表達(dá) （P＜0.05），而對TIMP-1 mRNA無明顯影響 （P＞0.05），提示其治療KOA的機(jī)制可能與其緩解炎癥、抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解進(jìn)而保護(hù)軟骨有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖與上述單味中藥研究結(jié)果具有相似性，但由于中藥復(fù)方具有復(fù)雜性，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平初步探討了中藥補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊在體內(nèi)入血后干預(yù)KOA的可能機(jī)制，即補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊含藥血清對IL-1β刺激的人原代軟骨細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與降低COX-2、iNOS、MMP-1、MMP-13 mRNA表達(dá)有關(guān)，為闡明該藥治療KOA的作用機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]趙傳喜,劉欣,吳淮,等.關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)配合補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊治療退行性膝關(guān)節(jié)炎遠(yuǎn)期療效觀察 [J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012(33): 3713-3714.

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（責(zé)任編輯： 常海慶）

Effect of Bushenqiangjin Capsule-Contained Serum on Interleukin-1β-Stimulated Human Chondrocytes

YAO Nan1,CHEN Neng2,3,XU Xuemeng2,HUANG Xuejun1,CAI Dake1,LIU Wen'gang2
(1Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM/Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510095,China;2Department of Orthopedics,Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital,Guangzhou 510095,China;3Graduate School,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To study the effect of Bushenqiangjin capsule-contained serum on interleukin-1β(IL-1β)-stimulated human chondrocytes.Methods The cultured human chondrocytes were treated with IL-1β(10 ng/mL)in the presence or absence of different concentration of Bushenqiangjin capsule-contained serum for 24 h.Nitric oxide(NO)and prostaglandin E2(PGE2)levels of cell culture supernate were assessed by Griess reaction and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)respectively,mRNA expressions of cyclooxgenase-2(COX-2),inducible nitric oxide synthase(iNOS),matrix metalloproteinase-1(MMP-1),matrix metalloproteinase-13 (MMP-13)and tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1)in chondrocytes were detected by RT-qPCR.Results Bushenqiangjin capsule-contained serum significantly reduced the NO and PGE2levels,also the mRNA expressions of COX-2,iNOS,MMP-1 and MMP-13. No obvious effect was found on the TIMP-1 mRNA expression in IL-1β-stimulated human chondrocytes.Conclusions Bushenqiangjin capsule-contained serum has certain protective effect on IL-1β-stimulated human chondrocytes and the protective mechanism is related with the decrease of mRNA expressions of COX-2,iNOS,MMP-1 and MMP-13 mRNA.

Bushenqiangjin capsule-contained serum;Interleukin-1β;Chondrocytes

R285.5

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0327

2016－10－31

廣東省自然科學(xué)基金 （2014A030310128）；廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2013B021800213）；廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2013B021800214）；廣東省中醫(yī)優(yōu)勢病種突破項(xiàng)目（粵中醫(yī)函 ［2015］19號）

姚楠 （1980－），男，博士學(xué)位，主管中藥師，主要從事中藥分子藥理學(xué)研究，E-mail：nanyao2000@126.com。