付曉燕，韓紅娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106）

來源于Cronobacter universalis的植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

付曉燕，韓紅娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海 201106）

按照畢赤酵母（Pichia pastoris）對(duì)密碼子的選擇偏向性，對(duì)來源于細(xì)菌（Cronobacter universalis）的植酸酶基因（以下命名為CuPhyS）進(jìn)行了密碼子優(yōu)化改造，合成并且作為外分泌蛋白成功地在畢赤酵母GS115里表達(dá)，CuPhyS的蛋白分泌量可積累到45μg/mL。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該酶的最適pH為4.0，最適溫度為50℃，在pH 3.0—12.0時(shí)該酶比較穩(wěn)定，在50℃下熱穩(wěn)定性較高；以植酸鈉作為底物，Mg2＋對(duì)酶活有一定的激活作用，Cu2＋對(duì)酶活有一定的抑制作用；該酶還具有良好的抗胰蛋白酶水解的能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。

植酸酶；Cronobacter universalis；畢赤酵母；酶學(xué)性質(zhì)

植酸酶（Phytase，E.C.3.1.3.8）是一種能降解植酸及其鹽類的水解酶。常用于動(dòng)物的飼料添加劑，存在于植物、動(dòng)物、真菌以及微生物中。植酸酶的應(yīng)用可以提高植物性飼料中磷的利用率，減少糞便中磷的排放量，從而降低環(huán)境中的磷污染，并可降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用［1］。在富含磷的油料、谷物等植物性飼料中，有80%以上的磷是以植酸或植酸鹽的形式存在［2］。迄今，植酸酶的研究已比較全面，主要集中在識(shí)別植酸酶的種類，改善植酸酶的酶學(xué)特性，研究其催化機(jī)制及其增加植酸酶產(chǎn)量［3］。植酸酶作為一種飼料添加劑，有著廣泛的應(yīng)用前景。但由于天然來源的植酸酶或者提取困難、或者分泌量太低、或者成本太高，難以滿足現(xiàn)實(shí)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的需要。構(gòu)建基因工程菌作為一個(gè)微型生物反應(yīng)器來獲得能高效表達(dá)植酸酶的菌株，成為解決這一問題的途徑。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是目前使用最廣泛的外源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，其外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量可達(dá)到g/L的水平，實(shí)現(xiàn)植酸酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)將大幅度提高植酸酶的發(fā)酵效價(jià)，進(jìn)一步降低植酸酶生產(chǎn)成本。本研究根據(jù)密碼子偏好性合成了一個(gè)來源于Cronobacter universalis的新型植酸酶基因CuPhyS，成功地在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌和表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（E.coli）DH5a為本研究室保存；巴斯德畢赤酵母菌株GS115（His－，Mut＋）購自Invitrogen公司；表達(dá)載體pYPX88（基因登錄號(hào)AY178045）由本研究室構(gòu)建。

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、Protein marker均購自Takara公司；脫糖基化酶Endoglycosidase H購自Biolab公司；植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）購自Sigma；胃蛋白酶和胰蛋白酶以及其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

2018第十六次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)術(shù)年會(huì)暨中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志第七屆第二次編委會(huì)議紀(jì)要（高娜 錢曉青 何子彧 韓朝）5∶插頁

LB培養(yǎng)基參見分子克?。?］，YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基均根據(jù)Invitrogen公司操作手冊(cè)配置。

1.2 方法

1.2.1 酵母表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)編碼C.universalis植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照畢赤酵母密碼子的偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下進(jìn)行序列改造，并使GC含量保持適中。利用PCR方法［5］成功地將來源于C.universalis的新型植酸酶基因（登錄號(hào)：CAKX01000221.1）的序列合成。將優(yōu)化的基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體pYPX88上，篩選挑出陽性克隆子，得到畢赤酵母植酸酶表達(dá)載體pYPX88-CuPhyS。

1.2.2 酵母的電擊轉(zhuǎn)化

用5 mL YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母GS115菌，30℃培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液1 mL接種于100 m L新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600＝1.6—1.8，然后根據(jù)Invitrogen手冊(cè)的方法制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒pYPX88-CuPhyS線性化后的DNA電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞（電壓175 kV，電阻400Ω，時(shí)間9.00ms）。轉(zhuǎn)化液冰置培養(yǎng)5min，取100μL涂布于SD-his固體平板上，30℃培養(yǎng)72 h至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。

1.2.3 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

將活性較強(qiáng)的菌液接種于100 mL BMGY（含1%甘油）中，28℃劇烈震蕩培養(yǎng)至OD600值約5.0，離心收集菌體，加入20 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY（含1%甲醇）懸浮菌體，繼續(xù)28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h添加一次甲醇。每隔6 h取樣檢測(cè)各菌株上清液的植酸酶活性，從中篩選出表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)化子。

根據(jù)酶活檢測(cè)方法［6］，植酸酶酶活單位（U）定義為：在37℃和pH 5.5的條件下，1 min內(nèi)從5.0 mmol/L的植酸鈉溶液中水解釋放出1μmol無機(jī)磷所需的酶量為1個(gè)酶活單位。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析及脫糖基化處理

取上清酶液1.5 mL流過用緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）平衡好的鎳柱（Ni2＋-NTA agarose affinity column），然后用洗滌液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，20 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）洗滌，最后用洗脫液C（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，250 mmol/L咪唑和300mmol/LNaCl）洗脫。其表達(dá)產(chǎn)物取8μL進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)取9μL上清液進(jìn)行脫糖基化處理，建立如下反應(yīng)體系：9μL上清液加1μL 10×Glycoprotein變性緩沖液，100℃煮沸10 min后使其變性，加1.0μL 10×G5緩沖液、1μL Endo H，37℃條件下反應(yīng)1 h。

1.2.5 表達(dá)植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

（1）最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定：用不同pH緩沖液調(diào)節(jié)底物pH。酶液在37℃與不同pH的底物反應(yīng)30 min后，相對(duì)活性最高所對(duì)應(yīng)的pH為最適pH。pH穩(wěn)定性是在不同pH的緩沖液條件下，37℃處理24 h，然后在最適條件下（最適pH，37℃，反應(yīng)30 min）測(cè)定酶活。（2）最適溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定：最適溫度是用0.2 mol/L NaAc-HAc（pH 4.0）稀釋好的植酸酶液與底物0.75 mmol/L植酸鈉在不同的溫度下反應(yīng)30 min后測(cè)定相應(yīng)的酶活性。對(duì)于溫度穩(wěn)定性，是將稀釋好的酶液分別在50℃、60℃和70℃水浴分別加熱不同時(shí)間后立即冰置冷卻，在37℃，pH 4.0條件下反應(yīng)30 min測(cè)定酶活。（3）不同金屬離子對(duì)植酸酶的影響：在含0.75 mmol/L植酸鈉底物的NaAc-HAc緩沖液（pH 4.0）中分別加入不同金屬離子、巰基化合物、變性劑和金屬螯合劑，在37℃，pH 4.0反應(yīng)30 min，以未加入金屬離子和其他化學(xué)試劑的緩沖液做空白對(duì)照。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)植酸酶影響的測(cè)定：用相應(yīng)的0.2 mol/L Gly-HCl（pH 2.0）和0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）分別稀釋好的胃蛋白酶和胰蛋白酶液與植酸酶按一定重量比例（蛋白酶/植酸酶w/w：1/500、1/250、1/100、1/1、100/1、250/1、500/1、1 000/1）混合，37℃下分別處理4 h，然后在pH 4.0條件下反應(yīng)30 min再測(cè)定酶活性，以未處理的初酶活性作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CuPhyS基因的合成和含CuPhyS基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

綜合影響基因表達(dá)的各種因素，在不改變氨基酸序列的前提下對(duì)植酸酶基因進(jìn)行改造，共改變了266個(gè)堿基，G＋C含量由原來的46.8%提高到50.6%，基本符合畢赤酵母G＋C的含量特征。

經(jīng)過改造的CuPhyS基因通過Xho I和Sac I位點(diǎn)定向插入酵母表達(dá)載體pYPX88，與其中的α-因子信號(hào)肽編碼序列的3’端融合，得到重組表達(dá)載體pYPX88-CuPhyS（圖1），通過酶切鑒定證實(shí)該重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示：CuPhyS基因和野生型基因有80%的同源性（圖2）。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pYPX88-CuPhyS圖譜Fig.1 Themap of recombinant expression plasm id pYPX88-CuPhyS

圖2 合成基因CuPhyS序列與野生型序列的同源性比對(duì)Fig.2 Sequence hom ology alignm ent between synthetic and w ild genes

2.2 重組植酸酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

SDS-PAGE分析結(jié)果表明（圖3），畢赤酵母表達(dá)的植酸酶其表觀分子量在49—58 kD，比從氨基酸序列推斷出的理論分子量（約46.5 kD）大，證明植酸酶基因不僅能有效分泌表達(dá)，而且表達(dá)產(chǎn)物還能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾-糖基化。另外，培養(yǎng)液中除了植酸酶蛋白外，其他蛋白質(zhì)幾乎不可見。將表達(dá)外源蛋白進(jìn)行脫糖基處理后，分子量約為45 kD，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)理論分子量相當(dāng)。

2.3 重組植酸酶CuPhyS的酶學(xué)性質(zhì)分析

表達(dá)的植酸酶各種酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明：（1）其最適pH為4.0，更偏酸性。在pH 3.5—5.0，植酸酶的相對(duì)活性均在70%以上。在pH 3.5—4.5，植酸酶的相對(duì)活性穩(wěn)定在90%以上（圖4-A）。因?yàn)閯?dòng)物胃里的pH為2.5，小腸pH為4.0—5.5，所以該重組植酸酶很適合動(dòng)物食用，在胃和小腸中均能發(fā)揮較高活性。另外，該植酸酶在pH 10—13.0均有活性，但當(dāng)pH小于1.0或大于13.0時(shí)，酶活力迅速下降（圖4-B）。（2）不同溫度下酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，該酶的最適溫度為50℃，在30—65℃，植酸酶的相對(duì)活性在50%以上（圖5-A）。60℃條件下處理10 min后，CuPhyS的剩余活性為20%；而70℃條件下處理2 min后CuPhyS的剩余活性僅為20%，處理10 min后，該酶的剩余活性幾乎為0，說明該酶耐熱性較差（圖5-B）。（3）植酸酶活性的發(fā)揮受到很多金屬離子及化學(xué)試劑的影響。在酶促反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子和化學(xué)試劑，分別測(cè)定酶活性，結(jié)果表明，金屬離子K＋、Na＋、Cr2＋、Ni2＋、Li＋、Ca2＋、NH4＋、Mg2＋、Ba2＋、Co2＋、Mn2＋、巰基化合物DTT及金屬螯合劑EDTA對(duì)CuPhyS有一定的激活作用，其中Ca2＋、NH4＋、Ba2＋、DTT及EDTA對(duì)CuPhyS的激活作用比較明顯；Pb2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋和變性劑SDS對(duì)CuPhyS的酶促反應(yīng)均有不同的抑制作用，Cu2＋和Zn2＋的抑制力較強(qiáng)，當(dāng)反應(yīng)體系中加入變性劑SDS時(shí)，酶已基本失去活性（圖6）。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)該酶的影響結(jié)果如圖7所示：用胃蛋白酶處理植酸酶CuPhyS，30 min后酶活性剩余20%，用胃蛋白酶處理90 min后，酶活性基本喪失。由于胃蛋白酶處理是在酸性條件下進(jìn)行的，可能是酸性環(huán)境對(duì)酶活性的影響與蛋白酶共同作用的結(jié)果。胰蛋白酶對(duì)CuPhyS的活性幾乎無影響，用胰蛋白酶處理180 min后酶活性為60%，說明植酸酶CuPhyS具有抗胰蛋白酶水解的能力。

圖3 表達(dá)植酸酶脫糖基前后的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of expressed phytase before and after deglycosy lated

圖4 重組植酸酶CuPhyS的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）Fig.4 The optimum pH（A）and pH stability（B）of recom binase CuPhyS

圖5 重組植酸酶CuPhyS的最適溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.5 The optimum tem perature（A）and thermal stability（B）of recombinase CuPhyS

圖6 各種金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)CuPhyS活性的影響Fig.6 Effects of variousm etal ions and chem icals on activity of CuPhyS

圖7 胰蛋白酶和胃蛋白酶處理對(duì)CuPhyS活性的影響Fig.7 Effects of trypsin and pepsin treatments on activity of CuPhyS

3 結(jié)論與討論

按照表達(dá)宿主的密碼子偏愛性對(duì)優(yōu)化外源基因的密碼子進(jìn)行改造，是提高外源基因表達(dá)量的一種有效方法［7-8］。畢赤酵母密碼子使用偏愛性尤為明顯，如Pro的密碼子CCG、Gly的密碼子GGG、Ala的密碼子GCG等在畢赤酵母高表達(dá)基因中的使用頻率為零，當(dāng)外源基因中含有這些密碼子時(shí)將嚴(yán)重制約其在畢赤酵母中的表達(dá)。本研究將CuPhyS基因中所有低偏愛性密碼子及大部分中等偏愛性密碼子替換為高偏愛性密碼子，使其在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。本研究已經(jīng)獲得一個(gè)來源于C.universalis并且成功表達(dá)在畢赤酵母的新型植酸酶蛋白，將該酶應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)將會(huì)極大程度地降低生產(chǎn)成本。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)會(huì)使外源蛋白進(jìn)行糖基化。如大多數(shù)真菌表達(dá)的植酸酶都會(huì)有不同程度的糖基化，糖基化便利了蛋白空間結(jié)構(gòu)的折疊，從而增加了蛋白的穩(wěn)定性［9］。對(duì)于植酸酶，糖基化主要是增加了其對(duì)溫度的穩(wěn)定性，而對(duì)最適pH和最適溫度則沒有影響［10］。脫糖基化處理結(jié)果表明，該酶蛋白為糖蛋白，不同程度的糖基化造成了其分子量的差異。而本研究中該分子量有差異的重組蛋白CuPhyS在酶學(xué)性質(zhì)上幾乎沒有差異。

植酸酶活性的發(fā)揮受到很多金屬離子的影響。Zn2＋和Cu2＋等多價(jià)離子可和酶底物植酸發(fā)生絡(luò)合作用，形成難溶的復(fù)合物，降低了植酸的有效濃度，從而降低酶的活性。Mg2＋能催化植酸的水解，當(dāng)它存在時(shí)植酸酶的活性得以提高。本試驗(yàn)還證明了Ca2＋、Mn2＋和EDTA也能激活植酸酶的活性。

目前，植酸酶在飼料應(yīng)用中主要存在三個(gè)方面的問題，其中主要問題是植酸酶的pH適用范圍、植酸酶的熱不穩(wěn)定性以及對(duì)胃、胰蛋白酶的耐受性［11］。本試驗(yàn)通過酶學(xué)性質(zhì)的比較分析表明，來源于C.universalis的植酸酶具有較高的耐熱性，很好地解決了飼料生產(chǎn)過程中因高溫制粒而造成的植酸酶活性損失較多的問題；其次，該酶還具有廣泛的pH耐受性，pH 1.5—6.5都能保持40%以上的酶活，說明該酶在動(dòng)物消化道內(nèi)的適應(yīng)性較強(qiáng)。對(duì)重組植酸酶的抗蛋白酶能力的研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗胰蛋白酶的能力，但抗胃蛋白能力較弱。與報(bào)道的非重組酶抗蛋白酶性質(zhì)［12］不同，其原因正在進(jìn)一步研究。如何使植酸酶具有高溫耐受性并且能在動(dòng)物正常體溫和腸胃pH條件下發(fā)揮最大活力，將是生產(chǎn)植酸酶制劑需要解決的重要問題。另外，隨著植酸酶應(yīng)用范圍的擴(kuò)展，目前在食品加工、肌醇和肌醇單磷酸鹽料添加劑生產(chǎn)等方面植酸酶也有應(yīng)用，根據(jù)本研究植酸酶的優(yōu)缺點(diǎn)，期望在不同的領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

The enzymological property of phytase from Cronobacter universalis

FU Xiao-yan，HAN Hong-juan，ZHU Bo，WANG Bo，PENG Ri-he ，YAO Quan-hong
（Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China）

According to the selection bias of Pichia pastoris toward a codon，a novel phytase gene（CuPhyS）from Cronobacter universalis was synthesized via codon optimization and successfully expressed as exocrine protein in P.pastoris GS115，and the protein secretion yield of CuPhyS could accumulate to approximately 45μg/mL.The research of the enzymological property showed that the optimal conditions for the phytase were pH 4.0 and 50℃，and itwas comparatively stable within pH 3.0—12.0 and had a good thermal stability at50℃.To a certain extent the enzyme activity was activated by Mg2＋and inhibited by Cu2＋.The phytase also had a good ability to resist hydrolyzation by trypsin and partial hydrolyzation by pepsin.

Phytase；Cronobacter universalis；Pichia pastoris；Enzymological property

S816.3

：A

1000-3924（2017）02-001-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.01

2016-02-22

付曉燕（1979—），女，碩士，助理研究員，研究方向：植物微生物基因工程。Tel：13564368816，E-mail：fuxiaoyan0211＠163.com

，彭日荷E-mail：pengrihe69＠yahoo.com；姚泉洪E-mail：yaoquanhong65＠yahoo.com