張灣+孫璐璐+趙曉祥

摘要：通過濃度梯度馴化，從活性污泥中分離到1株顏料紅23高效脫色菌ZW 4，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA基因序列分析，鑒定該好氧菌株為原壁菌（Prototheca sp.）。研究脫色菌ZW 4好氧條件、120 r/min對顏料紅23最適的脫色條件。結(jié)果表明，菌株最適宜的脫色條件為酵母粉濃度為1.0%、接種量為5%、pH值為7.5、溫度為35℃、鹽度小于2%，在此條件下，將濃度為100 mg/L的顏料紅23溶液好氧培養(yǎng)18 h，脫色率接近90%。對ZW4降解產(chǎn)物進(jìn)行紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)，菌株脫色機(jī)制主要為生物降解脫色；經(jīng)毒性試驗(yàn)表明，脫色后的顏料紅23毒性明顯降低。

關(guān)鍵詞：顏料紅23；分離；鑒定；生物脫色；毒性試驗(yàn)

中圖分類號：X172；X703 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0357—05

顏料生產(chǎn)是精細(xì)化工生產(chǎn)的重要門類之一，無論是有機(jī)顏料還是無機(jī)顏料，在其生產(chǎn)過程中均會(huì)產(chǎn)生對環(huán)境造成嚴(yán)重污染的廢水。有機(jī)顏料已普遍用于油墨、涂料、橡膠制品、塑料制品、文教用品和建筑材料物的著色，還用于合成纖維原漿著色和織物染料印花，是市場覆蓋面很大的化工產(chǎn)品。偶氮顏料是有機(jī)顏料中品種最多、產(chǎn)量最大的一類，研究和解決偶氮顏料生產(chǎn)廢水的處理方法，可以解決大部分顏料化工廠的廢水治理問題，具有很強(qiáng)的代表性。偶氮顏料與偶氮染料的分子結(jié)構(gòu)類似，具有相同的水質(zhì)特征，而偶氮染料是染料分子中含有偶氮基（—N=N—）結(jié)構(gòu)的統(tǒng)稱，主要污染因子為CODcr、色度、苯胺。很多偶氮顏料是以致癌芳香胺作為合成中間體的，其中色酚AS-D、AS-E、AS-OL和AS-TR作為紅色有機(jī)顏料的偶合組分，檢測時(shí)受還原劑作用使偶氮鍵斷裂，受高溫影響而導(dǎo)致2-羧基3-萘甲酰芳胺水解，產(chǎn)生鄰甲苯胺、對氯苯胺、鄰氨基苯甲醚和4-氯-2-甲基苯胺等致癌芳胺。陳榮圻列舉出一系列致癌芳胺的有機(jī)顏料，顏料紅23的分子式雖與報(bào)道中的顏料紅17僅有1個(gè)化學(xué)基團(tuán)的差異，但顏料紅23尚未被列入禁用偶氮顏料的目錄中。致癌芳香胺的發(fā)現(xiàn)促使顏料品種研發(fā)朝環(huán)保型方向發(fā)展，但是由于高牢度、高環(huán)保型顏料制作成本較高，使不少中小型印花廠望而卻步，非環(huán)保型偶氮顏料在市場上的應(yīng)用仍占主要地位。

微生物具有繁殖速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，利用高效脫色微生物進(jìn)行環(huán)境污染治理，不僅成本低，而且可減少二次污染，被認(rèn)為是染料脫色和降解最經(jīng)濟(jì)有效的方法。人工方法篩選對染料具有較強(qiáng)降解能力的高效菌，成為人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。目前，選育和培育優(yōu)良的脫色菌株或菌群是染料脫色降解的一個(gè)重要發(fā)展方向，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，已有很多關(guān)于脫色降解偶氮染料細(xì)菌、真菌、藻類等生物的報(bào)道，而對色酚類偶氮顏料微生物降解脫色的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。由于偶氮顏料不溶于水而只能溶于有機(jī)溶劑，本試驗(yàn)在篩選出對顏料紅23具有高效脫色能力菌株的基礎(chǔ)上，參考胡生等研究方法，選定6 mL/g二甲基亞砜為最佳有機(jī)溶劑，研究菌株對顏料紅23的脫色條件及性能，以期豐富偶氮顏料降解菌的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 活性污泥，來源于上海市松江污水處理廠二沉池；好氧污泥，取自序批式活性污泥法（SBR）反應(yīng)器，由活性污泥經(jīng)10 mg/L顏料紅23廢水馴化3～4周。

1.1.4主要儀器 BXM-30R型立式壓力蒸汽高壓滅菌鍋、PYX-DHS·400-BS型隔水式熱恒溫培養(yǎng)箱、SPH-2102C型立式雙層搖床、VS-840-1型超凈工作臺(tái)、UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)、雷磁PHS-3c型pH計(jì)、BSAl24S型電子分析天平、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Eclipse 80i型熒光顯微鏡。

1.2菌株分離、鑒定與菌液制備

1.2.1菌株的分離篩選 取1 mL SBR混合廢水上清液，加入到裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h；采用相同的方法，接種1代培養(yǎng)液1 mL至新鮮的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使樣品中的好氧菌群得到富集和活化；分裝100 mL 20 mg/L含顏料的篩選培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，接種1mL第l代活化菌液，篩選培養(yǎng)3～5 d；逐步增加篩選培養(yǎng)基中顏料的質(zhì)量濃度，濃度梯度依次為20、40、60、80、100 mg/L，對混合菌液連續(xù)篩選培養(yǎng)5代，直至顏料紅23的最終濃度為100 mg/L；取最后1次篩選培養(yǎng)基中的液體1 mL按梯度稀釋，涂布于固體分離培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)1～2 d；挑取有脫色圈且菌落明顯的菌株進(jìn)行反復(fù)劃線，分離獲得純菌株；將單菌落挑取到含顏料的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不同時(shí)間段測定脫色率，選取具有最強(qiáng)脫色能力的菌株進(jìn)行純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2菌株鑒定 菌株形態(tài)特征和生理生化特性的鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行；菌株ZW 4基因組DNA提取及測序分析委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行，并在NCBI中與相關(guān)的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，采用Mega程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3菌液的制備 將菌株接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床擴(kuò)大培養(yǎng)；取適量菌液于無菌離心管中，6 000 r/min離心10 min；收集菌體，無菌水洗滌菌體，重復(fù)操作3次；以等體積的無菌生理鹽水重懸。

1.3測定分析方法

1.3.1菌株的生長曲線及顏料降解曲線測定 將活化后的菌液按接種量10%接種到含有100 mg/L顏料紅23的篩選培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床擴(kuò)大培養(yǎng)，18 h內(nèi)按10個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取樣；以液體篩選培養(yǎng)基為空白對照，測定菌液在波長為600 nm處的吸光度；重復(fù)3次，取平均值，得到菌株的生長曲線。同樣時(shí)間點(diǎn)取10 mL菌液，離心；以液體篩選培養(yǎng)基作為空白對照，在波長為579 nm處測定顏料紅23的剩余吸光度，計(jì)算降解率；重復(fù)3次，取平均值，得到顏料的降解曲線。

1.3.2染料脫色影響因素研究 選取營養(yǎng)源、營養(yǎng)源濃度、接種量、pH值、溫度、鹽度作為主要考察因子。在含顏料的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素共計(jì)7種營養(yǎng)源，含量均為1%；加入10 mL菌液，30℃、120 r/min搖床擴(kuò)大培養(yǎng)，一定時(shí)間后測脫色率；將試驗(yàn)得到的最佳營養(yǎng)源添加到含顏料的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中構(gòu)成脫色培養(yǎng)基，研究其他各影響因素對顏料脫色效果的影響，僅對1個(gè)因子設(shè)置不同的影響梯度，其他最佳因素保持不變；均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

1.3.3脫色率計(jì)算 菌株對顏料的脫色能力采用脫色率表征。取10 mL反應(yīng)液，10 000 r/min離心6 min，取上清液于顏料最大吸收波長579 nm處測定吸光度D_t，以不接菌、含相同濃度顏料培養(yǎng)基的吸光度D。為對照，計(jì)算脫色率η，公式為：

1.3.4顏料脫色前后毒性測試 選取小麥和菜豆為試驗(yàn)材料，將顆粒飽滿、大小均勻的種子放置于培養(yǎng)皿中，用自來水沖洗2～3次；用2%H₂O₂消毒15 min，再用自來水清洗數(shù)次，于30℃溫水中浸種吸脹30 min；培養(yǎng)皿內(nèi)放人等直徑濾紙2張作為發(fā)芽床，每個(gè)發(fā)芽床上擺放20粒種子，光照培養(yǎng)箱中于25℃培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)，為保證種子發(fā)芽條件的適宜，必要時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充相應(yīng)溶液以保持水分，同時(shí)將感染霉菌的種子及時(shí)用蒸餾水沖洗；培養(yǎng)2、4、6、7、9 d，分別調(diào)查種子的發(fā)芽率，測量胚根、胚芽長度，選擇測量數(shù)據(jù)中最有規(guī)律的1組作為有效數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離篩選

分離得到4株對顏料紅23有脫色能力的菌株見圖2，其外形特征為：菌株ZW1的菌落呈紅色且不透明，邊緣整齊，表面光滑；菌株ZW2的菌落呈白色且不透明，圓形且較濕潤，邊緣整齊，不易挑起；菌株ZW3的菌落呈黃色且不透明，邊緣整齊，表面光滑；菌株ZW4的菌落為圓形、較小、扁平且有光澤，中央突起，邊緣整齊，表面光滑，菌落呈乳白色且不透明，易挑起。由表1可見，菌株ZW4在同一時(shí)間測得的脫色率最高。因此，后續(xù)試驗(yàn)選取脫色性能最好的菌株ZW4作為目標(biāo)菌株。

2.2優(yōu)勢菌株ZW4革蘭氏染色及生理生化特性

由圖3可見，優(yōu)勢菌株ZW4的革蘭氏染色為紫色，其為革蘭氏陽性菌。菌株ZW4經(jīng)葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，經(jīng)乙酞甲基甲醇、明膠液化、吲哚、尿素水解試驗(yàn)檢測均為陰性，經(jīng)苯丙氨酸脫氫酶、淀粉水解酶、過氧化氫酶試驗(yàn)檢測均為陽性，經(jīng)甲基紅試驗(yàn)檢測陰性、陽性均有。

2.3菌株的16S rRNA序列分析

由圖4可見，菌株ZW4與Prototheca sp.的相似度最高，達(dá)到89.7%，而低于一般相似度的97.5%，為疑似新種，將菌株ZW4命名為原壁菌（Prototheca sp.）。

2.4菌株的生長曲線及顏料紅23的脫色曲線

由圖5可見，度過前4 h的適應(yīng)期，菌體開始在培養(yǎng)基中快速生長，顏料的脫色與菌體生長同步；好氧培養(yǎng)8 h，菌體的D_600nm約達(dá)到0.59，此時(shí)顏料紅23的脫色率達(dá)到70%以上；培養(yǎng)18 h，菌體對顏料紅23的脫色率達(dá)到91.6%。結(jié)果說明菌株ZW4在含有顏料的培養(yǎng)基中能良好生長，且可對顏料紅23進(jìn)行有效脫色，是1株好氧條件下對顏料脫色能力較強(qiáng)的菌株。

2.5營養(yǎng)源對菌株ZW4脫色性能的影響

在沒有外加營養(yǎng)源的情況下，菌株無法生長，菌株不能以顏料紅23作為唯一碳源進(jìn)行代謝。由圖6可見，不同的營養(yǎng)源對菌株ZW4的脫色效果各異；脫色效果最好的2種營養(yǎng)源分別是酵母粉、蛋白胨，18 h脫色率分別可達(dá)到91.9%、88.1%，可能是由于這2種營養(yǎng)源均是復(fù)雜的有機(jī)含氮化合物，既能提供碳源又能提供氮源；無機(jī)氮源尿素作為營養(yǎng)源時(shí)，菌株的脫色效果很低，只有34%左右；牛肉膏、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉這4種營養(yǎng)源，也有較好的脫色效果。在后續(xù)的試驗(yàn)中，選取酵母粉作為顏料脫色菌株ZW4生長的營養(yǎng)源。

2.6酵母粉濃度對菌株ZW4脫色效果的影響

在含顏料的好氧培養(yǎng)基中設(shè)置0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%、1.5%、2.0%共7個(gè)酵母粉濃度。由圖7可見，顏料脫色率隨酵母粉濃度升高先呈增加趨勢，酵母粉濃度從0.1%增大到1.0%時(shí)，菌株培養(yǎng)18 h對染料的脫色率從58.9%增至90.9%；酵母粉濃度從1.0%增至2.0%時(shí)，顏料脫色率沒有明顯差異，約為90%。利用微生物處理染料廢水，過多的外加營養(yǎng)源會(huì)增加水體的COD及氨氮，造成水體二次污染，因此在對脫色率影響不大的情況下，應(yīng)選擇低濃度的營養(yǎng)源，故菌株脫色顏料的最適酵母粉濃度為1.0%。

2.7接種量對菌株ZW4脫色效果的影響

在顏料脫色培養(yǎng)基中設(shè)置1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%共9個(gè)接種量。由圖8可見，菌株ZW4接種量為5%時(shí)，脫色率達(dá)到87.8%；接種量從5%增至10%時(shí)，脫色率有所升高，但升幅并不大；接種量繼續(xù)增大，脫色率反而有所下降，可能是由于過大的接種量導(dǎo)致細(xì)菌之間發(fā)生營養(yǎng)、空間競爭性抑制作用；而接種量小于3%時(shí)，可能由于菌量較少，菌體生長較慢，脫色率低于70%。從成本和微生物生長繁殖等角度考慮，確定5%接種量為最適接種量。

2.8溫度對菌株ZW4脫色效果的影響

設(shè)置10、15、20、25、30、35、40、45、50℃共9個(gè)溫度梯度考察溫度對脫色效果的影響。由圖9可見，10、50℃時(shí)，菌株ZW4的脫色效果相對較差，18 h時(shí)脫色率分別為56.3%、56.5%，此時(shí)菌液D_600nm很低，這說明過低或過高的溫度抑制了菌株生長，從而降低了菌株的脫色性能；菌株在20～35℃范圍內(nèi)具有較好的脫色能力，18 h時(shí)脫色率達(dá)到85%左右；脫色最佳溫度為35℃，脫色率最高，可達(dá)到87.3%。這是由于隨著溫度的升高，偶氮染料的酶促反應(yīng)速率和菌體的生長速率加快，導(dǎo)致脫色效果提升，當(dāng)溫度增長過高，可能會(huì)引起菌體的重要組成成分如蛋白質(zhì)、核酸和酶等對溫度敏感的物質(zhì)發(fā)生不同程度破壞，從而影響菌株的脫色能力。因此，選擇35℃為試驗(yàn)最合適的溫度。

2.9 pH值對菌株ZW4脫色效果的影響

pH值是菌株生長和偶氮染料降解的一個(gè)重要參數(shù)，通過影響細(xì)胞質(zhì)膜的通透性和結(jié)構(gòu)來影響菌株的生長速率，對酶活性也有一定影響，一般偶氮染料脫色合適的pH值范圍在6.0～10.0之間，本試驗(yàn)將脫色培養(yǎng)基的pH值調(diào)為3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5共8個(gè)梯度。由圖10可見，pH值為3.5、4.5時(shí)，顏料的脫色率低于70%，此時(shí)菌株的D_600nm分別只有0.254、O.347，這說明過酸條件下，菌株生長受到抑制，從而影響脫色效果；pH值在5.5～9.5范圍，菌株均有很好的脫色能力，其中以pH值為7.5時(shí)脫色率最高，菌株培養(yǎng)18 h對顏料的脫色率達(dá)到88.5%。

2.10鹽度對菌株ZW4脫色效果的影響

在酵母粉1.0%、接種量5%、溫度35℃、pH值為7.5條件下，設(shè)置10個(gè)鹽度梯度以研究鹽度對菌株顏料脫色性能的影響。由圖11可見，鹽度小于2.0%時(shí)，染料的脫色率約為90%，低濃度的鹽溶液對菌株脫色能力沒有明顯影響，鹽度為0%、0.5%、1.0%、2.0%時(shí)菌體D_600nm分別為1.233、1.240、1.234、1.212；鹽度為2.0%～15.0%，顏料的脫色率不斷降低，菌株活性隨鹽度升高受到抑制，鹽度高達(dá)10%、12%、15%時(shí)，48 h時(shí)菌株的脫色率分別僅為66.5%、58.2%、49.1%，此時(shí)菌體濃度很低。因此，鹽度應(yīng)小于2%。

2.11顏料初始濃度對菌株ZW4脫色的影響

設(shè)置50、100、150、200、300、400、500 mg/L共7個(gè)顏料濃度梯度，以研究顏料初始濃度對菌株脫色性能的影響。由圖12可見，隨著顏料起始濃度的增加，相同時(shí)間段內(nèi)，菌株的脫色率逐漸降低；顏料起始濃度為50、100、150 mg/L時(shí)，菌株的脫色率達(dá)到90%所需的時(shí)間分別為18、24、42 h。菌株的脫色率隨顏料濃度的升高而降低，這可能是因?yàn)楦邼舛阮伭蠈暧卸靖弊饔?，從而抑制菌株對顏料紅23的脫色。

2.12顏料生物的脫色方式

微生物對偶氮染料的脫色機(jī)理一般可分為2大類，即吸附脫色和降解脫色。對脫色48 h的上清液進(jìn)行200～700 nm紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，染料特征吸收波長579 nm處的特征吸收明顯降低，這說明菌株P(guān)roto-theca sp.能較為徹底地降解顏料紅23；降解后菌液在388 nm左右處有新的吸收峰生成，這說明有新的物質(zhì)產(chǎn)生，顏料的生物脫色方式主要是降解脫色（圖13）。

2.13菌株脫色顏料紅23前后的毒性試驗(yàn)

通過比較2、4、6、7、9 d這5 d的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)9 d的數(shù)據(jù)有較好的規(guī)律。由表2可見，顏料紅23脫色前后處理的小麥、菜豆種子，其生長情況有明顯差異；與對照相比，顏料紅23脫色前的溶液明顯抑制小麥、菜豆種子胚芽和胚根的生長；經(jīng)菌株ZW4脫色后的顏料溶液處理種子，其生長雖不及對照，但較脫色前已有明顯改善，這可以說明顏料紅23經(jīng)菌株脫色后的毒性有明顯降低。

3結(jié)論與討論

Kodam等在好氧條件下，篩選出能快速生長、脫色范圍廣且對染料降解徹底的好氧細(xì)菌。。目前，國內(nèi)外尚未有顏料生物脫色方式的報(bào)道，能以降解物質(zhì)為唯一碳源的報(bào)道也很少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的菌株ZW4不能以顏料紅23作為唯一碳源生存；通過紫外-可見分光光度計(jì)測定發(fā)現(xiàn)，脫色后的顏料紅23廢水生成新的物質(zhì)，至于是何種物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。偶氮染料生物處理技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好型的方法，在處理工業(yè)廢水、印染廢水方面已得到廣泛應(yīng)用，但受到環(huán)境污染影響，實(shí)際應(yīng)用降解菌時(shí)常會(huì)發(fā)生降解菌總量減少、從自然界篩選到的降解菌降解酶活性普遍較低等問題。謝學(xué)輝等認(rèn)為，混合菌群往往對試驗(yàn)廢水具有更好的脫色率。本試驗(yàn)篩選出4株具有較好脫色能力的菌株，僅對優(yōu)勢菌株ZW4對顏料紅23廢水的脫色能力進(jìn)行研究，后續(xù)可以考慮選擇最佳的混合菌群以進(jìn)行顏料廢水脫色研究。

總之，通過本試驗(yàn)獲得結(jié)論主要有：從活性污泥中篩選出1株能高效脫色顏料紅23的菌株ZW4，經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定，該菌株與其他菌株同源性不高，有可能為1個(gè)新的菌種，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，暫將該菌株命名為原壁菌（Prototh-eca sp.）；菌株ZW4脫色顏料的最佳營養(yǎng)源是酵母粉，最適宜條件為酵母粉濃度1.0%、接種量5%、pH值7.5、溫度35℃，菌株耐鹽性能良好，在高達(dá)8%鹽濃度下對顏料有較好的脫色效果；紫外-可見分光光度計(jì)掃描脫色代謝產(chǎn)物的吸收圖譜發(fā)現(xiàn)，菌株ZW4對顏料脫色過程主要以生物降解為主；毒性試驗(yàn)表明，脫色后的顏料紅23對植物的毒性下降。