茆安婷 焦 雪 巴翠玉 李月紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院實驗室 吉林 長春 130118）

CODEHOP設(shè)計簡并引物克隆花羔紅點鮭肌鈣蛋白及其生物信息分析

茆安婷 焦 雪 巴翠玉 李月紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院實驗室 吉林 長春 130118）

本實驗通過無性生殖的方法得到了花羔紅點鮭肌鈣蛋白(Tnc)基因，并在使用生物信息學(xué)資源和生物軟件的條件下，通過CODEHOP的方法對特定的氨基酸序列設(shè)計簡并引物，并對得出的結(jié)果進行同源性分析同時構(gòu)建其相對系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明：通過CODEHOP的方法所設(shè)計出的引物簡并度較其他方法得到的引物簡并度低，DNA熔解溫度（Tm值）修改較方便，產(chǎn)物具有較強的特異性；肌鈣蛋白具有高度的保守性，將肌鈣蛋白基因片斷做結(jié)果比對，其編碼的氨基酸序列與斑馬魚同源性可達96%，與大西洋鮭Salmo salar同源性為92%，白斑狗魚Esoxlucius同源性為92%，虹鱒Oncorhynchus mykiss同源性為91%，斜帶石斑魚Epinepheluscoioides同源性為91%，斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus同源性為85%。

花羔紅點鮭；簡并引物； CODEHOP；肌鈣蛋白

花羔紅點鮭隸屬于鮭形目、鮭科、紅點鮭屬，俗稱花麗羔子，亦稱多麗鮭，享有“冷水魚之王”美譽，是一種中小型陸封魚類，在我國僅分布于黑龍江下游及河口、綏芬河支流、圖門江上游及其支流和鴨綠江上游及其支流，其中鴨綠江為我國花羔紅點鮭分布的南界。然而由于自然環(huán)境的變化導(dǎo)致水質(zhì)的下降，冷水魚的生存環(huán)境受到了極大的威脅，為此花羔紅點鮭已被我國列入《中國東北地區(qū)珍稀瀕危動物志》。

肌鈣蛋白C（Tro-ponin C，TnC）是一種能特異性與Ca離子結(jié)合的蛋白，其分子結(jié)構(gòu)具有4個螺旋—環(huán)—螺旋的特殊結(jié)構(gòu)，由于此特殊結(jié)構(gòu)而具有4個潛在的Ca離子結(jié)合位點。Ca離子信號傳導(dǎo)是機體細胞傳導(dǎo)信號最為廣泛的一種，而TnC的EF手圖像也同時參與Ca離子的信號傳導(dǎo)。TnC不僅可以與Ca離子結(jié)合還能與Mg離子結(jié)合，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化，機體內(nèi)一系列相關(guān)的酶活性及相關(guān)生理機能同時也發(fā)生了變化。而在TnC的作用下Ca離子的濃度高地，直接影響骨骼肌對肌蛋白生成，為此也會影響魚類的生長及肉質(zhì)。本實驗通過CODEHOP法設(shè)計簡并引物，得出其相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及樣品采集 實驗材料為延吉青龍采集的花羔紅點鮭幼魚心臟組織，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 TRIZol，購自Invitrogen 公司；Ex Tap酶（5 U/μL）、DNA Marker、dNTPs（2.5 mmol/L）、回收試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；IPTG、X-gal等，購自上生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 菌體和質(zhì)粒 大腸桿菌DH 5α，質(zhì)粒為pGEMT Easy Vector，購自Promega公司。

1.1.4 主 要數(shù) 據(jù) 庫與 軟件 DNAMAN、Oligo6.0、MEGA5.2、NCBI、Block Marker、CODEHOP。

1.2方法

1.2.1 設(shè)計簡并引物 從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索TnC（Troponin C）基因的氨基酸序列，并從中選取具有代表性的4個序列：斑馬魚Danio rerio（Genbank登錄號：NP852475）、大西洋鮭Salmo salar（Genbank登錄號：ADO29385）、斑點叉尾鮰Ictalurus punctatus（Genbank登錄號：ADO29385）、白斑狗魚Esoxlucius（Genbank登錄號：ACO13471）。在Block Marker網(wǎng)站上對上述4個序列進行比對，得到高度保守的連續(xù)氨基酸序列區(qū)。從Block Marker Results 網(wǎng)頁直接登錄CODEHOP數(shù)據(jù)庫進行引物設(shè)計。參數(shù)設(shè)置為：Maximum core degeneracy：128；Target clamp temperature: 60.0 ℃ Genetic code：standard；Codon usagetable：Danio rerio進行檢索。

1.2.2 簡并引物的篩選 篩選簡并引物時，根據(jù)設(shè)計引物的普遍原則和引物退火的最低溫度先篩選出一部分分值較高的引物，再根據(jù)保守區(qū)內(nèi)氨基酸的位置篩選出簡并度較低的引物，最后用其中一條魚的mRNA作為模板，先利用MEGA5.2查看引物與模板mRNA 的匹配性，選擇匹配度較高的引物，再利用Oligo6.0 進行引物自身的分析，引物的Tm值相差不宜超過5 ℃。

1.2.3 簡并擴增 TnC序列花羔紅點鮭心臟組織總RNA提取流程按照TRIZol試劑盒說明書進行操作。然后利用Oligo（dT） 20 合成cDNA 第一鏈，再用篩選好的簡并引物進行RT-PCR擴增。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)數(shù)為30；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物的鑒定、回收、克隆及測序RTPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；產(chǎn)物利用AxyGen公司瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒進行回收，得到目的基因片段；回收片段與Promega公司克隆載體試劑盒連接入pGEM-T Easy 載體，化學(xué)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5α內(nèi)，在藍白斑篩選板上涂布，將陽性白色克隆進行菌體提取質(zhì)粒酶切檢測，測序由華大基因科技服務(wù)有限公司完成。

1.2.5 TnC的序列分析測序回來的片段經(jīng)NCBIblast進行序列比對和同源性比較。

1.2.6 系統(tǒng)進化分析系統(tǒng)發(fā)生分析應(yīng)用MEGA5.2軟件分析，利用15種動物的氨基酸序列進行多重比對、構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 簡并引物設(shè)計結(jié)果

利用Block Marker 對4條魚的TnC氨基酸序列進行Block 比對，得到5個高度保守的氨基酸區(qū)域。再以CODEHOP設(shè)計引物，經(jīng)過篩選分析，得到1對引物，上游引物為5′-GCTGACCGAGGAGCAGaaraaygart-3′；下游引物為5′-CCTTCATGAACTCCAGGAActcrtcrtartc-3′。

2.2 簡并擴增電泳結(jié)果

以總RNA為模板（見圖1）用上述簡并引物進行RT-PCR 擴增，得到1條片段大小為1250bp的高度特異性條帶，與預(yù)測的結(jié)果基本一致。由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看見，這種引物的特異性強，沒有出現(xiàn)非特異性條帶（見圖2）。圖2中目的片段為TnC基因片段。

圖1 總RNART—PCR擴增結(jié)果

圖2 花羔紅點鮭心臟組織RT-PCR電泳檢測結(jié)果

2.3 TnC系統(tǒng)進化分析與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

為了探究TnC在進化中的穩(wěn)定性和保守性，本文中構(gòu)建了包含15種動物TnC氨基酸序列的進化樹(各動物TnC氨基酸序列Gen Bank accession number見表1)。進化樹如圖3。由系統(tǒng)進化樹可見，可以分為兩大支，其中一支為牛、野豬、人、獼猴、狨猴、小家鼠、褐家鼠、原雞、白斑狗魚、虹鱒、大西洋鮭，另一條分支上包含斑點叉尾鮰、斜帶石斑魚、鯉魚和斑馬魚。其中硬骨魚類單成一條分支，該分支中包含兩個支葉。第一支由白斑狗魚、紅鱒、大西洋鮭組成；第二支由斑點叉尾鮰、斜帶石斑魚、鯽魚和斑馬魚組成。通過NCBI將測序結(jié)果進行同源性比對，得出結(jié)果表明其所編碼的氨基酸序列與斑馬魚的同源性最高，可達到96%，與大西洋鮭同源性為92%，白斑狗魚同源性為92%，虹鱒同源性為91%，斜帶石斑魚同源性為91%，斑點叉尾鮰同源性為85%。

表1 14種動物TnC氨基酸序列

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圖3 15種動物TnC氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3 討論

在最初篩選基因時，本實驗通過CODEHOP設(shè)計的簡并引物，該方法避免了傳統(tǒng)方法所造成的諸多缺點，例如無需在龐大的基因庫尋找所需基因；同時降低了PCR產(chǎn)物的假陽性率，并且當(dāng)序列間親緣關(guān)系較遠或者拷貝數(shù)較低時，傳統(tǒng)方法一般都不適用，而CODEHOP則可以分離得到親緣關(guān)系較遠或低豐度的基因。在利用CODEHOP設(shè)計引物過程中，檢索出大量的引物序列，這同樣給引物篩選造成了一定的困難，本試驗在結(jié)合前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)化設(shè)計方法，結(jié)果證明切實可行。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外關(guān)于動物肌鈣蛋白的研究很少。本實驗應(yīng)用CODEHOP設(shè)計，首次設(shè)計可將部分序列成功克隆到pGEM-T載體上的花羔紅點鮭TnC基因的簡并引物，使目的基因可以穩(wěn)定復(fù)制并進一步確定Ca2+的信號傳導(dǎo)，為花羔紅點鮭的肌肉生長和肉質(zhì)研究提供重要的依據(jù)。更為探索魚類生物學(xué)功能、有益基因的篩選及Ca2+信號傳導(dǎo)提供了科學(xué)依據(jù)。魚類TnC基因的研究提供了基因、蛋白質(zhì)以及基因定位等方面的科學(xué)基礎(chǔ)。構(gòu)建進化樹提供了生物進化方面的數(shù)據(jù)支持。

（略）

國家自然科學(xué)基金(30972191)

茆安婷(1992-)，女，碩士，從事動物疾病及免疫研究，E-mail:569711008@qq.com

*通信作者：李月紅，E-mail:liyhong@sina.com