劉夢(mèng)云，申雨珂，靳羽曉，袁海娜，2，鮑文娜，2，尤玉如，劉士旺

（1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023）

反向高效液相色譜法分離檢測(cè)乳粉中的酪蛋白

劉夢(mèng)云1，2，3，申雨珂1，靳羽曉1，袁海娜1，2，鮑文娜1，2，尤玉如1，劉士旺1，2，3

（1.浙江科技學(xué)院生化學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310023；3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310023）

以C8色譜柱為分離柱，利用反相高效液相色譜法，在流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫25℃，0.1%TFA水溶液為A流動(dòng)相；100%乙腈溶液為B流動(dòng)相的梯度洗脫條件下對(duì)乳粉中酪蛋白的4種組分（αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）分離檢測(cè)。結(jié)果表明，該法具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性好，加標(biāo)回收率高，對(duì)全脂牛乳粉、羊乳粉等乳粉中酪蛋白組分的分離測(cè)定有很好的效果。

反相高效液相色譜；酪蛋白；牛乳粉；羊乳粉

0 引言

酪蛋白（Casein，CN）是乳品中重要的蛋白組分，主要包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白[1,2,3]，具有促進(jìn)磷、鈣等離子的吸收[4]和調(diào)節(jié)人體免疫等功能[5]。酪蛋白分子鏈中包含許多生物活性序列[6]且功能不同[7]，如α-CN是乳源生物活性肽的重要來(lái)源，但它會(huì)使酪蛋白膠束顆粒增大，易在嬰兒胃中結(jié)塊，不易消化[8]；β-CN適于配制嬰兒配方奶粉，提高配方乳粉的消化性[9]；κ-CN可刺激新生兒胃腸內(nèi)有益菌落的生長(zhǎng)。檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，使得乳蛋白的檢測(cè)變得快速、準(zhǔn)確[10-11]，由于液相色譜法具有較好的重現(xiàn)性，因此應(yīng)用較廣[12]。本研究通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件對(duì)全脂牛奶粉和羊奶粉中的酪蛋白進(jìn)行了分析和檢測(cè)，并對(duì)酪蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定與比較，以期為乳制品的安全檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

市售全脂牛乳粉，羊乳粉。

α-酪蛋白（α-CN），β-酪蛋白（β-CN），κ-酪蛋白（κ-CN）標(biāo)準(zhǔn)品，三氟乙酸（TFA）和甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

樣品緩沖液：含有濃度為8 mol/L尿素，濃度為165 mmol/L的Tris堿，濃度為44 mmol/L檸檬酸鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的DTT（pH=8.0）。

1.2 儀器設(shè)備與工作條件

1.2.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀（Waters e2695，2489紫外可見光檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；Sepax Bio-C8（4.6 nm×250 nm，300?，5 μm i.d.）；Satorius普及型PB－10 pH計(jì)；電子天平SCA－210。

1.2.2 工作條件

參考Ivan Bonizzi[13]的方法并稍作改動(dòng)，以C8色譜柱作為分離柱，并將柱子的再平衡時(shí)間延長(zhǎng)至15 min，流速由0.8 mL/min提高到1 mL/min，而流動(dòng)相B則由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%甲醇溶液替代原方法中的含有0.1%的乙腈溶液。

流動(dòng)相A：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的TFA水溶液；流動(dòng)相B：質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%甲醇溶液；梯度條件：0～40 min流動(dòng)相B從30%線性漸變到50%，40～42 min流動(dòng)相B從50%上升到100%，42～43 min流動(dòng)相B維持100%，43～46 min流動(dòng)相B則線性下降至30%，46～61 min為柱子的再平衡時(shí)間此時(shí)流動(dòng)相B為30%。

流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2 方法

2.1 酪蛋白的提取

取20 g奶粉，用40℃去離子水?dāng)嚢杈鶆?，使奶粉充分溶解。轉(zhuǎn)速為8 000 r/min（4℃）離心10 min，棄去上層脂肪，保留上清液。上清液用濃度為1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min（4℃）離心10 min，棄上層液。沉淀分別用去離子水、體積分?jǐn)?shù)為95%酒精、乙醇－乙醚（體積比1∶1）、乙醚各洗滌兩遍，真空抽濾，于55℃干燥箱烘干至恒重，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取5 mgα-CN，β-CN，κ-CN蛋白標(biāo)準(zhǔn)品于同一離心管中，加入5 mL樣品緩沖液，振蕩混勻后，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放入4℃冰箱備用。上機(jī)前用0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

2.3 酪蛋白樣品的制備

準(zhǔn)確稱量1.0 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入1 mL樣品緩沖液，混勻后室溫下靜置1 h，使樣品充分溶解。0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)在280 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，而肽鍵在200～220 nm處的紫外吸收則強(qiáng)于其280 nm處的吸收[14]。214 nm和220 nm被廣泛應(yīng)用于蛋白的檢測(cè)中，但因220 nm多用于液相中乳蛋白的檢測(cè)，因此本研究選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流速的選擇

流速的大小影響著蛋白質(zhì)的出峰時(shí)間以及分離效果，若流速較大會(huì)使色譜柱的負(fù)荷過(guò)大，造成柱子的損傷；若流速過(guò)小可能會(huì)在流動(dòng)過(guò)程中不能提供足夠的動(dòng)力，不利于蛋白質(zhì)的分離檢測(cè)，因此選擇1.0 mL/min作為實(shí)驗(yàn)流速。

3.3 純品酪蛋白組分的分離

含有α-CN，β-CN，κ-CN的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在色譜柱梯度洗脫程序中運(yùn)行61 min，4種酪蛋白組分在25 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)有效分離，且各組分酪蛋白的保留時(shí)間相比于Bonizzi等人[13]檢測(cè)方法（運(yùn)行時(shí)間51 min）顯著減少。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖，由于κ-CN的遺傳變異體A和B型中糖基化的不同程度，使κ-CN在色譜圖上的峰有3個(gè)[15]，并且因其分子量最小而率先被洗脫。αs1-CN和αs2-CN構(gòu)成了α-CN，因此在色譜圖上能明顯的看到αs1-CN和αs2-CN的兩個(gè)洗脫峰，這說(shuō)明α-CN實(shí)現(xiàn)了較好的分離[16]。為了能夠?qū)崿F(xiàn)酪蛋白組分的較好的分離，本實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)溶液放入4℃冰箱保存，這在一定程度上可以減少或避免蛋白質(zhì)的降解，減少實(shí)驗(yàn)誤差[13]。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本研究采用外標(biāo)法，準(zhǔn)確移取0.4，0.6，0.8，1.0 mL質(zhì)量濃度為5.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于1.5 mL離心管中，再分別加入0.6，0.4，0.2，0 mL樣品緩沖液，震蕩搖勻后即可得到質(zhì)量濃度分別為0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。根據(jù)蛋白濃度和相應(yīng)峰面積得到αs1-CN，αs2-CN，β-CN，κ-CN的標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）。結(jié)果表明，酪蛋白的質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積之間的線性相關(guān)系數(shù)R2有著遠(yuǎn)高于0.99的精度，可以滿足檢測(cè)要求。

表1 4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

3.5 方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取適量的自提酪蛋白，按照2.3的方法處理樣品。重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各蛋白組分的保留時(shí)間和峰面積，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算出相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示（表2），峰面積的RSD在1.06%～4.60%范圍內(nèi)，保留時(shí)間的RSD在0.57%～1.93%范圍內(nèi)，該方法具有很好的重復(fù)性。

表2 分析方法的重復(fù)性

3.6 加標(biāo)回收率分析

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的自提酪蛋白樣品，分別加入一定質(zhì)量濃度的α-CN，β-CN，κ-CN標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，按2.3方法處理后進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，4種酪蛋白的加標(biāo)回收率在95.2%～100.6%范圍之內(nèi)，RSD在0.58%～1.8%范圍之內(nèi)，說(shuō)明該方法有較高的回收率，并且在實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性良好。

表3 4種主要酪蛋白的回收率

3.7 樣品的差異性分析

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)自提的不同的酪蛋白組分進(jìn)行分離檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。兩種乳粉中的酪蛋白組分的色譜圖與酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)混合液的色譜圖相比，分離行為以及出峰順序較為一致[13]，即都含有4種主要的單體成分。羊乳酪蛋白與牛乳酪蛋白色譜結(jié)果相比，兩種奶中的K-CN的質(zhì)量濃度都比較低，但牛乳酪蛋白中αs1-CN和αs2-CN質(zhì)量濃度比較高，羊乳酪蛋白中β-CN質(zhì)量濃度則明顯的高于牛乳酪蛋白，并且兩種酪蛋白的組分質(zhì)量濃度也不相同[17]。由此可見，αs1-CN和αs2-CN，β-CN，κ-CN是構(gòu)成酪蛋白的主要成分[18]，并且不同的乳源中所含酪蛋白的質(zhì)量和比例也是不相同的，這種不相同在色譜圖上可以清晰地得到，差異性可能是因?yàn)槲锓N基因的不同造成的，并且乳蛋白的各種成分含量受季節(jié)、溫度、奶源的種類和健康狀況、擠乳時(shí)間及次數(shù)等諸多條件影響，會(huì)在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，從而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成的不同。兩種奶粉中酪蛋白的質(zhì)量如表4所示。

圖2 牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白的色譜

4 結(jié)論

反相高效液相色譜法是分離蛋白質(zhì)的有效且快速的方法，其高效穩(wěn)定的分離能力可很好的用于蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。本研究以C8為分離柱，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%TFA水溶液為A流動(dòng)相、100%乙腈溶液為B流動(dòng)相的梯度洗脫條件下，對(duì)經(jīng)過(guò)樣品緩沖液處理的乳粉中酪蛋白的組分進(jìn)行分析和檢測(cè)，獲得了很好的分離效果和定量結(jié)果。結(jié)果表明，該法具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），重復(fù)性好（RSD＜1.93%）加標(biāo)回收率高（95.2%～100.6%），對(duì)全脂牛乳粉、羊乳粉等乳粉中酪蛋白組分的分離測(cè)定有很好的效果。兩種乳粉中具有相同的酪蛋白成分，但是各種成分在含量上具有一定的差異。隨著對(duì)液相色譜方法研究的不斷深入、前處理方法以及分離體系的不斷完善和其他聯(lián)用檢測(cè)手段的快速發(fā)展，液相色譜方法必將能夠發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，在食品、蛋白質(zhì)分析檢測(cè)領(lǐng)域得到更加廣泛和實(shí)際的應(yīng)用。

表4 牛乳和羊乳粉中酪蛋白的含量測(cè)定

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Separation and quantification of casein in the milk powder by reversed-phase High Performance Liquid Chromatography

LIU Mengyun1，2，3，SHEN Yuke1，JIN Yuxiao1，YUAN Haina1，2，BAO Wenna1，2，YOU Yuru1，LIU Shiwang1，2，3
（1.School of Biological and Chemical Engineering/School of Light Industry，Zhejiang University of Science and Tech?nology，Hangzhou 310023，China；2.Zhejiang Provincial key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Prod?uct，Hangzhou 310023，China；3.Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center of Agricultural Biological Re?sources Biochemical Manufacturing，Hangzhou 310023，China）

The testing condition is the flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength of 220 nm，column temperature 25℃，0.1%TFA aqueous solution as A mobile phase，100%acetonitrile solution as mobile phase B.In this study，four components of casein(αS1-casein，αS2-casein，β-casein，andκ-casein)in milk powder were determined by reversed-phase high performance liquid chromatography with C8 column(4.6 nm×250 nm，300?，5μm i.d.).The results showed that the method had a good linearity，good reproducibility and high re?covery.For whole milk powder and goat milk powder，Separation and determination of casein components have a good effect.

Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography；casein；milk powder；sheep milk powder

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）03-0052-03

2016-09-17

浙江省自然科學(xué)基金資助（Y14C200036）。

劉夢(mèng)云（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘ぁ?/p>

劉士旺