同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩?/h1>
2017-05-15 02:12:10
中國乳品工業(yè) 2017年3期
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233）
同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩?/p>
楊晉青，虞成華，薛峰，秦宇，王磊，劉洋
（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海200233）
建立了一種嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩舻母咝б合嗌V-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈提取、濃縮、正己烷凈化，用高效液相色譜分離后，采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量檢測。線性范圍為5～100 ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.99，方法的定量檢出限為1.0 μg/kg（S/N=10）,高、中、低3個水平的加標(biāo)回收率為81.5%～112.4%。
高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜；嬰兒配方奶粉；雌二醇
0 引言
雌激素是一類可直接影響動物代謝和繁殖，具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的類固醇激素。該類物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可激活和抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，造成機(jī)體代謝調(diào)控紊亂，甚至可導(dǎo)致發(fā)育異?；蚰[瘤等[1-2]，被歐盟等國在食用性動物飼養(yǎng)中列為禁用品[3]。目前，雌激素的殘留檢測研究主要集中在水產(chǎn)品、人血清、飲用水等[4-12]，在嬰幼兒奶粉中鮮見報道。嬰幼兒奶粉作為嬰兒除母乳外唯一的食物來源，其安全性對嬰幼兒的健康至關(guān)重要[13]。
本文針對應(yīng)用最廣泛的類固醇激素——雌二醇，建立其在嬰幼兒奶粉中的檢測方法。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在已有標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化了提取凈化條件，利用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，建立了嬰幼兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩舻拇_證方法。為實(shí)現(xiàn)嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舯O(jiān)控，保障嬰幼兒奶粉的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料與試劑
試劑：甲醇，乙腈，乙酸乙酯，正己烷，均為色譜純；氨水(分析純)，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水（Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備）。
標(biāo)準(zhǔn)品：雌二醇（CAS號：50-28-2）純度≥99.0%；雌二醇-13C2（100 μg/mL溶于乙腈中），于-20℃保存。
1.2 儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀，三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，NH2固相萃取小柱(500 mg，3 cc);其他設(shè)備包括超聲儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Vortex Genius 3型漩渦混合器，離心機(jī)。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制
準(zhǔn)確稱取10.0 mg的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃避光保存?zhèn)溆?。臨用前標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；雌二醇-13C2則配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。
1.3.2 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制
吸取不同體積標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用空白樣品提取液配成不同質(zhì)量濃度（ng/mL）的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.4 儀器條件
1.4.1 超高效液相色譜條件:
色譜柱：C18高效液相色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)。流動相：A為0.1%氨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫步驟如表1所示；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10 L。
表1 梯度洗脫步驟
1.4.2 質(zhì)譜條件
離子源為ESI源；掃描方式為負(fù)離子；氣簾氣為20 L/min；GS1為30 L/min；GS2為20 L/min；輔助加熱氣溫度為400℃；噴霧電壓為-4500 V；碰撞氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%)；數(shù)據(jù)采集模式為MRM。定性定量離子對、碰撞能量等參數(shù)如表2所示，MRM結(jié)果如圖1所示。
表2 雌二醇的質(zhì)譜參數(shù)
1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證
定性測定：被測物質(zhì)組分選擇1個母離子，2個子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間偏差在±2.5以內(nèi)；且樣品圖譜中待測組分定性離子的相對豐度接近標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜中對應(yīng)的定性離子的相對豐度，若偏差不超過表3所規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對應(yīng)的待測物。
表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
定量測定：在儀器的最佳工作條件下，分別測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中雌二醇的峰面積，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量計算。
圖1 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測圖
圖2 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖
1.5 樣品前處理方法
1.5.1 提取
稱取5 g奶粉試樣，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其最終定容濃度均為10 ng/mL。加入10 mL水溶解，再加入25 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，然后加入5 g NaCl，振搖2 min，以10 000 r/min離心5 min后，以10 000 r/min離心5 min。上清液倒入100 mL雞心瓶中，殘?jiān)偌尤?5 mL乙腈，重復(fù)上述操作一次。合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在45℃水浴中真空濃縮至干，準(zhǔn)確加入2 mL乙腈水溶液（2+8）溶解殘?jiān)ㄓ糜谝阂狠腿艋粶?zhǔn)確加入2 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）溶解殘?jiān)ㄓ糜诠滔噍腿艋?/p>
1.5.2 凈化
1.5.2.1 液液萃取凈化
將上述溶液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入1 mL正己烷，渦旋1 min，以4 000 r/min離心10 min。取下層清液，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。
1.5.2.2 固相萃取凈化
用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）活化平衡小柱，取備用液上樣，控制流速不超過1滴/s；用10 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）洗脫，收集洗脫液，用微氮?dú)饬鞔蹈?，?.0 ml乙腈-水溶液(1+9)超聲溶解殘?jiān)?，漩渦混勻，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。
2 結(jié)果與討論
2.1 液相色譜條件的優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters XbridgeTMC18和Agilent ZORBAX SB-C18兩根色譜柱在乙腈-水和甲醇-水兩種流動相洗脫下的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，雌二醇在兩根C18柱的保留行為差別不大，采用甲醇-水體系作為流動相時易產(chǎn)生拖尾；考慮到節(jié)約成本和液相儀器的匹配問題，最終選用了Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18作為實(shí)驗(yàn)用柱。同時，分別比較了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mM乙酸銨/乙腈這幾種流動相對目標(biāo)化合物離子化程度的影響，研究結(jié)果表明，采用0.1氨水溶液與乙腈作為流動相洗脫，獲得了理想的峰形，質(zhì)譜信號最強(qiáng)。若在流動相中添加醋酸銨會使信號降低，這可能離子源中離子濃度過高會抑制雌二醇的電離，從而導(dǎo)致離子化效率下降的緣故。
2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
雌二醇具有一定的弱極性或中等極性，選擇電噴霧(ESI)離子源分別在正離子、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，對比兩種模式，得出雌二醇負(fù)離子模式的離子峰強(qiáng)度比正離子峰強(qiáng)度高很多。而且其分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，因此選擇負(fù)離子模式檢測，首先進(jìn)行一級母離子全掃描，確定其母離子，再用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析，，選擇豐度相對較高、質(zhì)荷比較大的兩個特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣，碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使雌二醇的母離子與特征碎片子離子的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。結(jié)果表明：雌二醇在負(fù)離子化模式下易形成一級特征離子峰[M-H]-271.0(m/z)和很強(qiáng)的二級特征離子峰為182.8(m/z)，具體的二級特征離子峰見圖2。
實(shí)驗(yàn)中使用HPLC-MS/MS測定時有基質(zhì)抑制效應(yīng)存在．用陰性奶粉經(jīng)過提取、凈化定容后配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和直接配制的同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，信號下降30%左右，從而直接導(dǎo)致回收率偏低．為了補(bǔ)償由于基質(zhì)抑制效應(yīng)導(dǎo)致的測定數(shù)值偏差問題，采用基質(zhì)匹配曲線(Matrix matched calibration curve)來校正最終結(jié)果。
2.3 樣品前處理方法的確定
本文采用乙腈作為提取溶劑，主要是考慮到乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時具有沉淀蛋白的作用，且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。實(shí)驗(yàn)中比較了用15 mL乙腈分別提取不同次數(shù)的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取兩次的回收率達(dá)到85%以上。超聲時間是對結(jié)果影響較大的因素之一，為此對不同超聲時間進(jìn)行了試驗(yàn)。分別選取了5 min，10 min和15 min三個時間點(diǎn)，在相同條件下對分析物進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)超聲10 min后，樣品的回收率就能達(dá)到90%以上。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
乳粉基質(zhì)復(fù)雜，由于配方奶粉中含有較高脂肪，對雌二醇產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)抑制。提取凈化前添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)比提取凈化后添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)強(qiáng)，為了減少基質(zhì)效應(yīng)對雌性激素的抑制，通過液液萃取和SPE兩個方法凈化樣品，均可減少基體成分的干擾。選取正己烷去油脂進(jìn)行樣品凈化，效果較好。綜合考慮各種影響因素，最終樣品提取方法選定用15 mL乙腈提取兩次，超聲時間為10 min，液液萃取凈化，以獲得最佳的回收率。
2.4 線性范圍和檢出限
線性范圍是指試樣量與響應(yīng)訊號之間保持線性關(guān)系的范圍。將配制好的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液用空白樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度為5，10，25，50，100 ng/mL；按上述質(zhì)譜條件分離測定，以質(zhì)量濃度(P)和相應(yīng)的定量離子峰面積比值(A)作線性回歸，得到雌二醇回歸方程為Y=0.00338X+0.00861，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以一空白奶粉作為試驗(yàn)樣品，加入一定量雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，按上述檢測方法測定，用質(zhì)譜軟件進(jìn)行測定，以S/N=3/1為最低定性限(LOD)，S/N=10/1為最低定量限(LOQ)，樣品的定量下限為1.0 g/kg。
2.5 回收率和精密度試驗(yàn)
取經(jīng)檢驗(yàn)不含雌二醇的樣品，分別按樣品中1、2、10 g/kg含量水平添加一定量的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一添加濃度重復(fù)6份樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法測定，計算其回收率和精密度。得到1～10 g/kg添加水平范圍的回收率見表5。
表5 雌二醇回收率及精密度（n=6）
2.6 實(shí)際樣品測試
使用本文建立的檢測方法，對從超市中購買的30份嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行了檢測，結(jié)果均未檢出含有雌二醇。
3 結(jié)論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文建立的HPLC-ESI-MS/MS方法具有特異性強(qiáng)、前處理簡單、重復(fù)性好等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的HPLC分離方法比較，分析時間大大縮短，靈敏度更高，定量下限為1.0 μg/kg。串聯(lián)質(zhì)譜MRM采集方式的高選擇性使得方法的準(zhǔn)確度更高，同時采用Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μ m)色譜柱使目標(biāo)物和雜質(zhì)得到較好的分離。該方法非常適合嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舻目焖贆z測。
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Determination of estradiol residues in dairy products by isotope internal stan?dard-liquid chromatography tandem mass spectrometry
YANG Jinqing,YU Chenghua,XUE Feng,QIN Yu，WANG Lei,LIU Yang
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）
A sensitive method for determination of estradiol in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/ MS）was established.The food sample was extracted by acetonitrile and concentrated and purified by n-hexane,then was separated and de?termined by HPLC-ESI-MS-MS.A linear calibration curve was obtained in the concentration range of 5～100 ng/mL.The linear correla?tion cofficients of the method are above 0.99.The detection limit of method（LOQ）is 1.0 μg/kg（S/N=10）.The recoveries in three levels rang from 81.5%～112.4%.
HPLC;mass spectrometry;infant formula;estradiol
TS252.7
：A
：1001-2230（2017）03-0055-04
2016-04-05
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301486）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13ZR1439600）。
楊晉青（1983-），男，助理工程師，從事食品與化妝品分析測試。
劉洋
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本文針對應(yīng)用最廣泛的類固醇激素——雌二醇，建立其在嬰幼兒奶粉中的檢測方法。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在已有標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化了提取凈化條件，利用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，建立了嬰幼兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩舻拇_證方法。為實(shí)現(xiàn)嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舯O(jiān)控，保障嬰幼兒奶粉的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 材料與試劑
試劑：甲醇，乙腈，乙酸乙酯，正己烷，均為色譜純；氨水(分析純)，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水（Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備）。
標(biāo)準(zhǔn)品：雌二醇（CAS號：50-28-2）純度≥99.0%；雌二醇-13C2（100 μg/mL溶于乙腈中），于-20℃保存。
1.2 儀器與設(shè)備
高效液相色譜儀，三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，NH2固相萃取小柱(500 mg，3 cc);其他設(shè)備包括超聲儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Vortex Genius 3型漩渦混合器，離心機(jī)。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制
準(zhǔn)確稱取10.0 mg的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃避光保存?zhèn)溆?。臨用前標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；雌二醇-13C2則配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。
1.3.2 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制
吸取不同體積標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用空白樣品提取液配成不同質(zhì)量濃度（ng/mL）的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.4 儀器條件
1.4.1 超高效液相色譜條件:
色譜柱：C18高效液相色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)。流動相：A為0.1%氨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫步驟如表1所示；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10 L。
表1 梯度洗脫步驟
1.4.2 質(zhì)譜條件
離子源為ESI源；掃描方式為負(fù)離子；氣簾氣為20 L/min；GS1為30 L/min；GS2為20 L/min；輔助加熱氣溫度為400℃；噴霧電壓為-4500 V；碰撞氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%)；數(shù)據(jù)采集模式為MRM。定性定量離子對、碰撞能量等參數(shù)如表2所示，MRM結(jié)果如圖1所示。
表2 雌二醇的質(zhì)譜參數(shù)
1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證
定性測定：被測物質(zhì)組分選擇1個母離子，2個子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間偏差在±2.5以內(nèi)；且樣品圖譜中待測組分定性離子的相對豐度接近標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜中對應(yīng)的定性離子的相對豐度，若偏差不超過表3所規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對應(yīng)的待測物。
表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
定量測定：在儀器的最佳工作條件下，分別測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中雌二醇的峰面積，以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量計算。
圖1 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測圖
圖2 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖
1.5 樣品前處理方法
1.5.1 提取
稱取5 g奶粉試樣，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其最終定容濃度均為10 ng/mL。加入10 mL水溶解，再加入25 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，然后加入5 g NaCl，振搖2 min，以10 000 r/min離心5 min后，以10 000 r/min離心5 min。上清液倒入100 mL雞心瓶中，殘?jiān)偌尤?5 mL乙腈，重復(fù)上述操作一次。合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在45℃水浴中真空濃縮至干，準(zhǔn)確加入2 mL乙腈水溶液（2+8）溶解殘?jiān)ㄓ糜谝阂狠腿艋粶?zhǔn)確加入2 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）溶解殘?jiān)ㄓ糜诠滔噍腿艋?/p>
1.5.2 凈化
1.5.2.1 液液萃取凈化
將上述溶液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入1 mL正己烷，渦旋1 min，以4 000 r/min離心10 min。取下層清液，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。
1.5.2.2 固相萃取凈化
用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）活化平衡小柱，取備用液上樣，控制流速不超過1滴/s；用10 mL二氯甲烷-甲醇溶液（7+3）洗脫，收集洗脫液，用微氮?dú)饬鞔蹈?，?.0 ml乙腈-水溶液(1+9)超聲溶解殘?jiān)?，漩渦混勻，過0.22 μm濾膜后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。
2 結(jié)果與討論
2.1 液相色譜條件的優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters XbridgeTMC18和Agilent ZORBAX SB-C18兩根色譜柱在乙腈-水和甲醇-水兩種流動相洗脫下的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，雌二醇在兩根C18柱的保留行為差別不大，采用甲醇-水體系作為流動相時易產(chǎn)生拖尾；考慮到節(jié)約成本和液相儀器的匹配問題，最終選用了Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18作為實(shí)驗(yàn)用柱。同時，分別比較了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mM乙酸銨/乙腈這幾種流動相對目標(biāo)化合物離子化程度的影響，研究結(jié)果表明，采用0.1氨水溶液與乙腈作為流動相洗脫，獲得了理想的峰形，質(zhì)譜信號最強(qiáng)。若在流動相中添加醋酸銨會使信號降低，這可能離子源中離子濃度過高會抑制雌二醇的電離，從而導(dǎo)致離子化效率下降的緣故。
2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
雌二醇具有一定的弱極性或中等極性，選擇電噴霧(ESI)離子源分別在正離子、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，對比兩種模式，得出雌二醇負(fù)離子模式的離子峰強(qiáng)度比正離子峰強(qiáng)度高很多。而且其分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，因此選擇負(fù)離子模式檢測，首先進(jìn)行一級母離子全掃描，確定其母離子，再用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析，，選擇豐度相對較高、質(zhì)荷比較大的兩個特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣，碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使雌二醇的母離子與特征碎片子離子的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。結(jié)果表明：雌二醇在負(fù)離子化模式下易形成一級特征離子峰[M-H]-271.0(m/z)和很強(qiáng)的二級特征離子峰為182.8(m/z)，具體的二級特征離子峰見圖2。
實(shí)驗(yàn)中使用HPLC-MS/MS測定時有基質(zhì)抑制效應(yīng)存在．用陰性奶粉經(jīng)過提取、凈化定容后配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和直接配制的同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，信號下降30%左右，從而直接導(dǎo)致回收率偏低．為了補(bǔ)償由于基質(zhì)抑制效應(yīng)導(dǎo)致的測定數(shù)值偏差問題，采用基質(zhì)匹配曲線(Matrix matched calibration curve)來校正最終結(jié)果。
2.3 樣品前處理方法的確定
本文采用乙腈作為提取溶劑，主要是考慮到乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時具有沉淀蛋白的作用，且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。實(shí)驗(yàn)中比較了用15 mL乙腈分別提取不同次數(shù)的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取兩次的回收率達(dá)到85%以上。超聲時間是對結(jié)果影響較大的因素之一，為此對不同超聲時間進(jìn)行了試驗(yàn)。分別選取了5 min，10 min和15 min三個時間點(diǎn)，在相同條件下對分析物進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)超聲10 min后，樣品的回收率就能達(dá)到90%以上。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
乳粉基質(zhì)復(fù)雜，由于配方奶粉中含有較高脂肪，對雌二醇產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)抑制。提取凈化前添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)比提取凈化后添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)強(qiáng)，為了減少基質(zhì)效應(yīng)對雌性激素的抑制，通過液液萃取和SPE兩個方法凈化樣品，均可減少基體成分的干擾。選取正己烷去油脂進(jìn)行樣品凈化，效果較好。綜合考慮各種影響因素，最終樣品提取方法選定用15 mL乙腈提取兩次，超聲時間為10 min，液液萃取凈化，以獲得最佳的回收率。
2.4 線性范圍和檢出限
線性范圍是指試樣量與響應(yīng)訊號之間保持線性關(guān)系的范圍。將配制好的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液用空白樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度為5，10，25，50，100 ng/mL；按上述質(zhì)譜條件分離測定，以質(zhì)量濃度(P)和相應(yīng)的定量離子峰面積比值(A)作線性回歸，得到雌二醇回歸方程為Y=0.00338X+0.00861，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以一空白奶粉作為試驗(yàn)樣品，加入一定量雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，按上述檢測方法測定，用質(zhì)譜軟件進(jìn)行測定，以S/N=3/1為最低定性限(LOD)，S/N=10/1為最低定量限(LOQ)，樣品的定量下限為1.0 g/kg。
2.5 回收率和精密度試驗(yàn)
取經(jīng)檢驗(yàn)不含雌二醇的樣品，分別按樣品中1、2、10 g/kg含量水平添加一定量的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一添加濃度重復(fù)6份樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法測定，計算其回收率和精密度。得到1～10 g/kg添加水平范圍的回收率見表5。
表5 雌二醇回收率及精密度（n=6）
2.6 實(shí)際樣品測試
使用本文建立的檢測方法，對從超市中購買的30份嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行了檢測，結(jié)果均未檢出含有雌二醇。
3 結(jié)論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文建立的HPLC-ESI-MS/MS方法具有特異性強(qiáng)、前處理簡單、重復(fù)性好等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的HPLC分離方法比較，分析時間大大縮短，靈敏度更高，定量下限為1.0 μg/kg。串聯(lián)質(zhì)譜MRM采集方式的高選擇性使得方法的準(zhǔn)確度更高，同時采用Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，3.5 μ m)色譜柱使目標(biāo)物和雜質(zhì)得到較好的分離。該方法非常適合嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舻目焖贆z測。
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Determination of estradiol residues in dairy products by isotope internal stan?dard-liquid chromatography tandem mass spectrometry
YANG Jinqing,YU Chenghua,XUE Feng,QIN Yu，WANG Lei,LIU Yang
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）
A sensitive method for determination of estradiol in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/ MS）was established.The food sample was extracted by acetonitrile and concentrated and purified by n-hexane,then was separated and de?termined by HPLC-ESI-MS-MS.A linear calibration curve was obtained in the concentration range of 5～100 ng/mL.The linear correla?tion cofficients of the method are above 0.99.The detection limit of method（LOQ）is 1.0 μg/kg（S/N=10）.The recoveries in three levels rang from 81.5%～112.4%.
HPLC;mass spectrometry;infant formula;estradiol
TS252.7
：A
：1001-2230（2017）03-0055-04
2016-04-05
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301486）；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13ZR1439600）。
楊晉青（1983-），男，助理工程師，從事食品與化妝品分析測試。
劉洋
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