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        同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩?/h1>
        2017-05-15 02:12:10
        中國乳品工業(yè) 2017年3期
        關(guān)鍵詞:雌二醇串聯(lián)奶粉

        (上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海200233)

        同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩?/p>

        楊晉青,虞成華,薛峰,秦宇,王磊,劉洋

        (上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海200233)

        建立了一種嬰兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩舻母咝б合嗌V-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈提取、濃縮、正己烷凈化,用高效液相色譜分離后,采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量檢測。線性范圍為5~100 ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)r大于0.99,方法的定量檢出限為1.0 μg/kg(S/N=10),高、中、低3個水平的加標(biāo)回收率為81.5%~112.4%。

        高效液相色譜;串聯(lián)質(zhì)譜;嬰兒配方奶粉;雌二醇

        0 引言

        雌激素是一類可直接影響動物代謝和繁殖,具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的類固醇激素。該類物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后,可激活和抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)功能,造成機(jī)體代謝調(diào)控紊亂,甚至可導(dǎo)致發(fā)育異?;蚰[瘤等[1-2],被歐盟等國在食用性動物飼養(yǎng)中列為禁用品[3]。目前,雌激素的殘留檢測研究主要集中在水產(chǎn)品、人血清、飲用水等[4-12],在嬰幼兒奶粉中鮮見報道。嬰幼兒奶粉作為嬰兒除母乳外唯一的食物來源,其安全性對嬰幼兒的健康至關(guān)重要[13]。

        本文針對應(yīng)用最廣泛的類固醇激素——雌二醇,建立其在嬰幼兒奶粉中的檢測方法。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,在已有標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上,優(yōu)化了提取凈化條件,利用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,建立了嬰幼兒配方奶粉中雌二醇?xì)埩舻拇_證方法。為實(shí)現(xiàn)嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舯O(jiān)控,保障嬰幼兒奶粉的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 材料與試劑

        試劑:甲醇,乙腈,乙酸乙酯,正己烷,均為色譜純;氨水(分析純),水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水(Milli-Q Synthesis超純水系統(tǒng)制備)。

        標(biāo)準(zhǔn)品:雌二醇(CAS號:50-28-2)純度≥99.0%;雌二醇-13C2(100 μg/mL溶于乙腈中),于-20℃保存。

        1.2 儀器與設(shè)備

        高效液相色譜儀,三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,NH2固相萃取小柱(500 mg,3 cc);其他設(shè)備包括超聲儀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,Vortex Genius 3型漩渦混合器,離心機(jī)。

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

        準(zhǔn)確稱取10.0 mg的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,制備成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-18℃避光保存?zhèn)溆?。臨用前標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液;雌二醇-13C2則配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。

        1.3.2 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液配制

        吸取不同體積標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用空白樣品提取液配成不同質(zhì)量濃度(ng/mL)的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

        1.4 儀器條件

        1.4.1 超高效液相色譜條件:

        色譜柱:C18高效液相色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)。流動相:A為0.1%氨水溶液,B為乙腈,梯度洗脫步驟如表1所示;流速為0.2 mL/min;柱溫為30℃;進(jìn)樣體積為10 L。

        表1 梯度洗脫步驟

        1.4.2 質(zhì)譜條件

        離子源為ESI源;掃描方式為負(fù)離子;氣簾氣為20 L/min;GS1為30 L/min;GS2為20 L/min;輔助加熱氣溫度為400℃;噴霧電壓為-4500 V;碰撞氣為高純氮?dú)猓ā?9.999%);數(shù)據(jù)采集模式為MRM。定性定量離子對、碰撞能量等參數(shù)如表2所示,MRM結(jié)果如圖1所示。

        表2 雌二醇的質(zhì)譜參數(shù)

        1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證

        定性測定:被測物質(zhì)組分選擇1個母離子,2個子離子,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間偏差在±2.5以內(nèi);且樣品圖譜中待測組分定性離子的相對豐度接近標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜中對應(yīng)的定性離子的相對豐度,若偏差不超過表3所規(guī)定的范圍,則可判定樣品中存在對應(yīng)的待測物。

        表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

        定量測定:在儀器的最佳工作條件下,分別測定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中雌二醇的峰面積,以內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量計算。

        圖1 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測圖

        圖2 雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜圖

        1.5 樣品前處理方法

        1.5.1 提取

        稱取5 g奶粉試樣,精確至0.01 g,置于50 mL離心管中,加入適量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使其最終定容濃度均為10 ng/mL。加入10 mL水溶解,再加入25 mL乙腈,渦旋1 min,超聲10 min,然后加入5 g NaCl,振搖2 min,以10 000 r/min離心5 min后,以10 000 r/min離心5 min。上清液倒入100 mL雞心瓶中,殘?jiān)偌尤?5 mL乙腈,重復(fù)上述操作一次。合并提取液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上,在45℃水浴中真空濃縮至干,準(zhǔn)確加入2 mL乙腈水溶液(2+8)溶解殘?jiān)ㄓ糜谝阂狠腿艋粶?zhǔn)確加入2 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)溶解殘?jiān)ㄓ糜诠滔噍腿艋?/p>

        1.5.2 凈化

        1.5.2.1 液液萃取凈化

        將上述溶液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中,加入1 mL正己烷,渦旋1 min,以4 000 r/min離心10 min。取下層清液,過0.22 μm濾膜后,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。

        1.5.2.2 固相萃取凈化

        用6 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)活化平衡小柱,取備用液上樣,控制流速不超過1滴/s;用10 mL二氯甲烷-甲醇溶液(7+3)洗脫,收集洗脫液,用微氮?dú)饬鞔蹈?,?.0 ml乙腈-水溶液(1+9)超聲溶解殘?jiān)?,漩渦混勻,過0.22 μm濾膜后,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。按上述操作步驟制備樣品空白提取液。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

        實(shí)驗(yàn)分別考察了Waters XbridgeTMC18和Agilent ZORBAX SB-C18兩根色譜柱在乙腈-水和甲醇-水兩種流動相洗脫下的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明,雌二醇在兩根C18柱的保留行為差別不大,采用甲醇-水體系作為流動相時易產(chǎn)生拖尾;考慮到節(jié)約成本和液相儀器的匹配問題,最終選用了Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18作為實(shí)驗(yàn)用柱。同時,分別比較了水/甲醇,水/乙腈,0.1%氨水溶液/甲醇,0.1%氨水溶液/乙腈,2 mM乙酸銨/乙腈這幾種流動相對目標(biāo)化合物離子化程度的影響,研究結(jié)果表明,采用0.1氨水溶液與乙腈作為流動相洗脫,獲得了理想的峰形,質(zhì)譜信號最強(qiáng)。若在流動相中添加醋酸銨會使信號降低,這可能離子源中離子濃度過高會抑制雌二醇的電離,從而導(dǎo)致離子化效率下降的緣故。

        2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        雌二醇具有一定的弱極性或中等極性,選擇電噴霧(ESI)離子源分別在正離子、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,對比兩種模式,得出雌二醇負(fù)離子模式的離子峰強(qiáng)度比正離子峰強(qiáng)度高很多。而且其分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,因此選擇負(fù)離子模式檢測,首先進(jìn)行一級母離子全掃描,確定其母離子,再用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析,,選擇豐度相對較高、質(zhì)荷比較大的兩個特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優(yōu)化離子化電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣,碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù),使雌二醇的母離子與特征碎片子離子的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。結(jié)果表明:雌二醇在負(fù)離子化模式下易形成一級特征離子峰[M-H]-271.0(m/z)和很強(qiáng)的二級特征離子峰為182.8(m/z),具體的二級特征離子峰見圖2。

        實(shí)驗(yàn)中使用HPLC-MS/MS測定時有基質(zhì)抑制效應(yīng)存在.用陰性奶粉經(jīng)過提取、凈化定容后配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和直接配制的同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液相比,信號下降30%左右,從而直接導(dǎo)致回收率偏低.為了補(bǔ)償由于基質(zhì)抑制效應(yīng)導(dǎo)致的測定數(shù)值偏差問題,采用基質(zhì)匹配曲線(Matrix matched calibration curve)來校正最終結(jié)果。

        2.3 樣品前處理方法的確定

        本文采用乙腈作為提取溶劑,主要是考慮到乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時具有沉淀蛋白的作用,且?guī)С龅娜鯓O性成分較少。實(shí)驗(yàn)中比較了用15 mL乙腈分別提取不同次數(shù)的提取效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取兩次的回收率達(dá)到85%以上。超聲時間是對結(jié)果影響較大的因素之一,為此對不同超聲時間進(jìn)行了試驗(yàn)。分別選取了5 min,10 min和15 min三個時間點(diǎn),在相同條件下對分析物進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)超聲10 min后,樣品的回收率就能達(dá)到90%以上。

        2.4 基質(zhì)效應(yīng)

        乳粉基質(zhì)復(fù)雜,由于配方奶粉中含有較高脂肪,對雌二醇產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)抑制。提取凈化前添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)比提取凈化后添加待測物的基質(zhì)抑制效應(yīng)強(qiáng),為了減少基質(zhì)效應(yīng)對雌性激素的抑制,通過液液萃取和SPE兩個方法凈化樣品,均可減少基體成分的干擾。選取正己烷去油脂進(jìn)行樣品凈化,效果較好。綜合考慮各種影響因素,最終樣品提取方法選定用15 mL乙腈提取兩次,超聲時間為10 min,液液萃取凈化,以獲得最佳的回收率。

        2.4 線性范圍和檢出限

        線性范圍是指試樣量與響應(yīng)訊號之間保持線性關(guān)系的范圍。將配制好的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)貯備液用空白樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度為5,10,25,50,100 ng/mL;按上述質(zhì)譜條件分離測定,以質(zhì)量濃度(P)和相應(yīng)的定量離子峰面積比值(A)作線性回歸,得到雌二醇回歸方程為Y=0.00338X+0.00861,相關(guān)系數(shù)r=0.9986。在5~100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以一空白奶粉作為試驗(yàn)樣品,加入一定量雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品,按上述檢測方法測定,用質(zhì)譜軟件進(jìn)行測定,以S/N=3/1為最低定性限(LOD),S/N=10/1為最低定量限(LOQ),樣品的定量下限為1.0 g/kg。

        2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

        取經(jīng)檢驗(yàn)不含雌二醇的樣品,分別按樣品中1、2、10 g/kg含量水平添加一定量的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,每一添加濃度重復(fù)6份樣品,按上述實(shí)驗(yàn)方法測定,計算其回收率和精密度。得到1~10 g/kg添加水平范圍的回收率見表5。

        表5 雌二醇回收率及精密度(n=6)

        2.6 實(shí)際樣品測試

        使用本文建立的檢測方法,對從超市中購買的30份嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行了檢測,結(jié)果均未檢出含有雌二醇。

        3 結(jié)論

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本文建立的HPLC-ESI-MS/MS方法具有特異性強(qiáng)、前處理簡單、重復(fù)性好等特點(diǎn),與傳統(tǒng)的HPLC分離方法比較,分析時間大大縮短,靈敏度更高,定量下限為1.0 μg/kg。串聯(lián)質(zhì)譜MRM采集方式的高選擇性使得方法的準(zhǔn)確度更高,同時采用Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μ m)色譜柱使目標(biāo)物和雜質(zhì)得到較好的分離。該方法非常適合嬰幼兒奶粉中雌二醇?xì)埩舻目焖贆z測。

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        Determination of estradiol residues in dairy products by isotope internal stan?dard-liquid chromatography tandem mass spectrometry

        YANG Jinqing,YU Chenghua,XUE Feng,QIN Yu,WANG Lei,LIU Yang
        (Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research,Shanghai 200233,China)

        A sensitive method for determination of estradiol in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/ MS)was established.The food sample was extracted by acetonitrile and concentrated and purified by n-hexane,then was separated and de?termined by HPLC-ESI-MS-MS.A linear calibration curve was obtained in the concentration range of 5~100 ng/mL.The linear correla?tion cofficients of the method are above 0.99.The detection limit of method(LOQ)is 1.0 μg/kg(S/N=10).The recoveries in three levels rang from 81.5%~112.4%.

        HPLC;mass spectrometry;infant formula;estradiol

        TS252.7

        :A

        :1001-2230(2017)03-0055-04

        2016-04-05

        國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301486);上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13ZR1439600)。

        楊晉青(1983-),男,助理工程師,從事食品與化妝品分析測試。

        劉洋

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