李勇傳，石永杰，嘉紅云，黃思聰

(1.廣州市紅十字會醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510260)

MiR-105抑制肝癌細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)研究

李勇傳1，石永杰2，嘉紅云2，黃思聰2

(1.廣州市紅十字會醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510260)

目的探討miR-105對人肝癌細(xì)胞增殖的影響及可能機(jī)制。方法改變QGY-7703及HepG2兩種細(xì)胞的miR-105表達(dá)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂增殖試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的改變；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變。結(jié)果細(xì)胞克隆形成和軟瓊脂增殖實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR-105可抑制QGY-7703及HepG2細(xì)胞增殖，反之抑制miR-105表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖；細(xì)胞流式檢測顯示miR-105過表達(dá)能促進(jìn)兩種癌細(xì)胞G0/G1期阻滯。結(jié)論miR-105抑制肝癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制與引起細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

MiR-105；肝細(xì)胞癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

我國肝癌發(fā)病率高居惡性腫瘤病譜第四位，病死率為腫瘤死因譜第二位，且每年持續(xù)上升[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma cells，HCC)是目前肝癌的主要類型，盡管現(xiàn)在對肝癌的診斷和治療方法較過去都有了很大的提高，但HCC的5年存活率仍然只有5%，且遠(yuǎn)期療效很不理想[2]?，F(xiàn)階段HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還存在很多未知領(lǐng)域。研究表明，microRNA在HCC的病理進(jìn)程中起重要作用，并可能成為HCC診斷和治療的新方向[3]。近年發(fā)現(xiàn)miR-105對部分腫瘤來說可能是一個(gè)有效的抑癌基因[4-5]，但其對HCC的作用目前尚未清晰。因此本研究希望通過體外實(shí)驗(yàn)研究miR-105表達(dá)對QGY-7703及HepG2兩種人類肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討miR-105在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用和可能機(jī)制，為HCC的治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株QGY-7703和HepG2細(xì)胞由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分子實(shí)驗(yàn)室留存，常規(guī)方法復(fù)蘇后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，TRIzol溶液、Lipofectamine 2000、Opti-MEI溶液購自美國Invitrogen公司。miR-105模擬物、miR-105抑制物、陰性對照購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分別用陰性對照(NC)、miR-105模擬物(miR-105)和miR-105抑制物(miR-105-in)轉(zhuǎn)染QGY-7703及HepG2細(xì)胞。用Opti-MEI稀釋待轉(zhuǎn)染核酸至濃度為0.02 μg/μL，加入LipofectamineTM2000/Opti-MEI混勻液，置室溫20 min后加入待轉(zhuǎn)染的貼壁細(xì)胞中，4～6 h后更換培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)QGY-7703和HepG2細(xì)胞種于6孔板(每孔0.5×103個(gè)細(xì)胞)連續(xù)培養(yǎng)10 d，觀察克隆(＞50個(gè)細(xì)胞的集落為1個(gè)克隆)的生長情況。用10%甲醛固定10 min，1.0%結(jié)晶紫染色5 min，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)量。結(jié)果以miR-105/NC、miR-105-in/NC克隆數(shù)量比值表示。

1.5 軟瓊脂增殖實(shí)驗(yàn)取2×103的QGY-7703和HepG2細(xì)胞懸浮在2 mL含有0.33%瓊脂的完全培養(yǎng)基中。0.66%完全培養(yǎng)基瓊脂混合物作為瓊脂底層，瓊脂細(xì)胞混合物作為瓊脂上層。培養(yǎng)10 d后，用目鏡測微尺計(jì)數(shù)克隆直徑＞0.1 mm的細(xì)胞集落。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期收集消化后的QGY-7703及HepG2細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入80%冰冷乙醇的PBS溶液固定。細(xì)胞沉淀后重懸，加入2 μg/mL牛胰RNA酶，37℃培養(yǎng)30 min，隨后在10 μg/mL碘化丙啶中室溫孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA的含量，重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Exce2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組計(jì)量資料比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-105表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與NC組比較，miR-105組的QGY-7703和HepG2細(xì)胞克隆數(shù)量比值為(0.28±0.08)、(0.22±0.06)(圖1A)；miR-105-in組克隆數(shù)量比值分別為(2.80±0.30)、(3.20±0.50)(圖1B)。軟瓊脂增殖實(shí)驗(yàn)顯示，NC組的菌落數(shù)量約(50±5)個(gè)，miR-105組的QGY-7703和HepG2細(xì)胞菌落數(shù)量為(17±2)個(gè)、(15±1)個(gè)(圖1C)；miR-105-in組克隆數(shù)量比值分別為(135±15)、(155±25)(圖1D)。表明miR-105的過表達(dá)可導(dǎo)致QGY-7703和HepG2細(xì)胞克隆及菌落數(shù)量明顯下降(P＜0.05)；抑制miR-105表達(dá)兩種細(xì)胞的克隆及菌落數(shù)量則明顯增多(P＜0.05)。

圖1 miR-105在克隆形成和軟瓊脂增殖實(shí)驗(yàn)中對HCC細(xì)胞增殖的影響(與NC比較，aP＜0.05)

2.2 miR-105表達(dá)對肝癌細(xì)胞周期的影響與NC比較，miR-105過表達(dá)的兩種細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞所占比例均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而抑制miR-105表達(dá)后，兩種細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞所占比例則顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 miR-105表達(dá)對HCC細(xì)胞G0/G1期比例的影響

3 討論

miRNA的失調(diào)經(jīng)常發(fā)生在各種人類腫瘤中，miRNA表達(dá)的異?？赏ㄟ^影響多個(gè)基因的表達(dá)最終導(dǎo)致人類癌癥形成[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤類型中，miR-105表達(dá)都有改變，如前列腺癌患者的癌變組織和血中均發(fā)現(xiàn)miR-105表達(dá)下調(diào)，且在體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其下調(diào)有助于前列腺腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。結(jié)腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)miR-105表達(dá)顯著下調(diào)[7]。提示miR-105可能對部分腫瘤具有較大的抑制作用。

本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-105的過表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的克隆及集落數(shù)量下降；反之抑制miR-105表達(dá)腫瘤細(xì)胞的克隆及集落數(shù)量明顯增多。提示miR-105過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，而抑制其表達(dá)，則使肝癌細(xì)胞增殖加速。說明對于HCC，miR-105有可能通過抑制肝癌細(xì)胞增殖而發(fā)揮其抑癌作用。

從一定意義上講，腫瘤是多基因變化導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞失控性生長所導(dǎo)致的一類細(xì)胞周期性疾病[8]。一個(gè)完整的細(xì)胞周期有G0、G1、S、G2、M五個(gè)時(shí)期，細(xì)胞DNA的含量隨各時(shí)相呈現(xiàn)周期性變化。流式細(xì)胞儀根據(jù)細(xì)胞增殖時(shí)各階段的DNA含量不同，將細(xì)胞的復(fù)制期分為G0/G1、S、G2/M期。具有2C DNA含量的細(xì)胞為G0/G1期細(xì)胞，具有4C DNA含量的細(xì)胞為G2/M期細(xì)胞，DNA含量介于G1和G2期之間為S期細(xì)胞[9]。本次流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-105能使QGY-7703和HepG2兩種肝癌細(xì)胞處于G0/G1期的比例增多，表明miR-105有使肝癌細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯的能力，而抑制miR-105表達(dá)，癌細(xì)胞G0/G1期的比例減少，表示進(jìn)入S期的細(xì)胞比例會相應(yīng)增加。結(jié)果提示miR-105表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其影響細(xì)胞周期改變有關(guān)。

綜上所述，miR-105也許在抑制HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的積極作用，有望能成為針對HCC治療的有效作用靶點(diǎn)，為原發(fā)性肝癌的治療提供新的治療方向。

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MiR-105 suppress the proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

LI Yong-chuan1,SHI Yong-jie2,JIA Hong-yun2,HUANG Si-cong2.1.Department of Clinical Laboratory,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220, Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of miR-105 expression on the proliferation of human hepatocellular carcinoma(HCC)cells.MethodsOver-expression of miR-105 was transfected by miR-105 mimics,and inhibition of miR-105 expression was transfected by miR-105 inhibitors.The effects of miR-105 expression on the proliferation of QGY-7703 and HepG2 cells were detected by colony formation assay and soft agar proliferation experiment. Flow cytometry was used to examine the influence of miR-105 expression on the cell cycle distribution of HCC cells. ResultsColony formation assay and soft agar proliferation experiment showed that,the proliferation of QGY-7703 and HepG2 cells were suppressed by miR-105 over-expression(P＜0.05),while miR-105 inhibitor accelerated the proliferation of HCC cells.The G0/G1phase cells dramatically increased in the miR-105 over-expressing QGY-7703 and HepG2 cells,while decreased in miR-105-inhibited cells.ConclusionMiR-105 inhibits the proliferation of HCC cells.The mechanisms may be related to the cell cycle arrested.

miR-105;Hepatocellular carcinoma;Cell proliferation;Cell apoptosis

R735.7

A

1003—6350（2017）07—1038—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.003

2016-10-11)

廣東省廣州市科技和信息化局項(xiàng)目(編號：2014J4100063)

黃思聰。E-mail：58218826@qq.com