施蕊++王娟+葉敏+趙能++夏箐++李彪

摘要：為研究滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性，先從滇重樓塊莖中分離得到98株內(nèi)生真菌，對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，其中有8株內(nèi)生真菌對(duì)供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用；內(nèi)生真菌發(fā)酵液初提物抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的提取物對(duì)供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43、PPC-78，其他菌株的發(fā)酵液提取物對(duì)供試植物病原菌沒有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：滇重樓內(nèi)生菌；分離；發(fā)酵液提取物；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0086-02

滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnansensis （Franch.） Hand]分布于云南省、貴州省和四川省，生長(zhǎng)在海拔 1 400～3 100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡內(nèi)。滇重樓根莖入藥，有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于疔腫癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等癥狀[1]。另外，滇重樓的次生代謝產(chǎn)物甾體皂苷有止血、祛痰、抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗早孕殺精子、抗細(xì)胞毒素等作用，臨床上用于治療功能性子宮出血、神經(jīng)性皮炎、外科炎癥以及腫瘤等，具有顯著的療效[2-6]。隨著新藥的研究開發(fā)，滇重樓成為著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊等產(chǎn)品的主要原料，制藥工業(yè)需求量逐年遞增，滇重樓供不應(yīng)求[7]。由于滇重樓種子有“二次休眠”現(xiàn)象，種苗繁育存在巨大困難[8]。目前滇重樓的繁殖方法主要是根莖切塊繁殖和組織培養(yǎng)等，但是在育苗過程中創(chuàng)口和組培苗容易受到病原菌侵染，導(dǎo)致滇重樓根腐病大面積發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。植物內(nèi)生菌在植物抵御外來(lái)有害病菌入侵、促進(jìn)種子萌發(fā)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和植物有效成分代謝等方面起著重要的作用[9-13]。但是，有關(guān)滇重樓內(nèi)生真菌的研究不多。

因此，研究滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性，有利于提高植物的抗病性；同時(shí)，研究結(jié)果能為共生真菌與植物的共生關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，為滇重樓的人工栽培提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1滇重樓塊莖來(lái)源滇重樓塊莖于2014年采自云南省普洱市。

1.1.2培養(yǎng)基試驗(yàn)用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3供試病原菌供試病原菌由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，供試病原菌株編號(hào)及名稱見表1，采用的病原菌均為植物土傳病害病菌。

1煙草黑脛病菌（Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker）

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1滇重樓內(nèi)生菌分離取健康滇重樓植株的根狀莖，棄泥土，用水沖洗干凈，晾干水分，按照以下步驟進(jìn)行表面殺菌處理：0.2%氯化汞消毒10～30 s，無(wú)菌水沖洗，75%乙醇消毒 10～60 s，無(wú)菌水沖洗，處理完畢后在無(wú)菌條件下將滇重樓樣品切成2 cm×2 cm的小塊，種植于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)5～10 d，觀察培養(yǎng)基中有無(wú)菌落形成，挑取菌落轉(zhuǎn)接入PDA斜面培養(yǎng)基中，按常規(guī)微生物學(xué)法分離、純化和保藏。

1.2.2對(duì)峙試驗(yàn)滇重樓內(nèi)生真菌的抑菌活性測(cè)定采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法，各供試病原菌和滇重樓內(nèi)生真菌置于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，用打孔器（直徑6 mm）沿其菌落邊緣打菌餅，將內(nèi)生真菌與病原菌菌餅接種于PDA平板上距中心 15 mm 處同一直線上的2點(diǎn)中，同時(shí)以只接病原菌和內(nèi)生真菌的平板作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)，每24 h觀察1次，選擇能夠抑制供試植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的內(nèi)生菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，準(zhǔn)備其發(fā)酵代謝物的抑菌活性研究。

1.2.3發(fā)酵液中代謝物質(zhì)的萃取將選擇的有抑菌活性的內(nèi)生菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、220 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)基中布滿菌絲，停止培養(yǎng)，挑去菌絲，用等量乙酸乙酯萃取10 h，65 ℃減壓蒸餾濃縮至2 mL，自然揮干稱質(zhì)量，加乙酸乙酯2 mL保存。

1.2.4萃取物抑菌試驗(yàn)利用1/10 000天平稱量?jī)?nèi)生菌發(fā)酵液粗提物，用無(wú)菌水將各溶劑萃取物分別稀釋成15、10、5 mg/mL 的溶液。配制馬鈴薯培養(yǎng)基，滅菌，備用。無(wú)菌條件下，將稀釋的不同發(fā)酵液粗提物與馬鈴薯培養(yǎng)基在（40±5） ℃ 條件下以1 ∶9的比例混合，倒入培養(yǎng)皿，冷卻制成有毒培養(yǎng)基平板后分別接入供試病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、煙草黑脛病菌菌餅（直徑9 mm），每個(gè)濃度、每個(gè)菌種均設(shè)3皿重復(fù)。以不加提取物的馬鈴薯培養(yǎng)基為對(duì)照。觀察菌落生長(zhǎng)情況，在第7天測(cè)量菌落直徑，抑菌率按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

抑菌率=對(duì)照病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑1對(duì)照病原菌菌落直徑×100%。（1）

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1滇重樓內(nèi)生真菌和對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果

從滇重樓植物中分離得到98株內(nèi)生真菌，將這些內(nèi)生真菌與供試植物病原菌進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)。由表2可見，滇重樓內(nèi)生真菌PPC-78和PPC-43對(duì)供試植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有很強(qiáng)的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC-78對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率達(dá)到了100.00%；內(nèi)生菌PPC-25的抑菌效果也很好，對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌的抑制率在58.83%～7281%之間；內(nèi)生真菌PPC-03、PPC-21、PPC-32、PPC-71和PPC-73對(duì)立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌也有不同程度的抑制效果。

2.2發(fā)酵液對(duì)立枯絲核菌的抑菌活性

采用對(duì)峙試驗(yàn)中能夠抑制病原真菌生長(zhǎng)的菌株發(fā)酵液初提物對(duì)立枯絲核病菌進(jìn)行抑制試驗(yàn)。

由表3可以看出，對(duì)峙試驗(yàn)有抑菌效果的8株滇重樓內(nèi)生菌中，發(fā)酵液提取物對(duì)供試植物病原菌有抑菌作用的菌株僅有3株，它們分別是PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他

內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物對(duì)供試病原菌沒有抑制作用；PPC-25、PPC-43、PPC-78發(fā)酵液提取物對(duì)立枯絲核菌的抑菌率分別是9.76%、37.21%、67.44%，對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率分別是8.65%、62.55%、83.11%，對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌率分別是5.07%、47.66%、77.49%。相比而言，PPC-78發(fā)酵液提取物的抑菌活性最強(qiáng)，PPC-43次之，PPC-25最弱。其他菌株的發(fā)酵液初提物對(duì)供試植物菌株沒有抑制作用，但是活體對(duì)峙試驗(yàn)有抑制作用，可能的原因有2點(diǎn)：（1）營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)；（2）植物病原菌刺激內(nèi)生真菌產(chǎn)生有抑菌活性的物質(zhì)。

3結(jié)論與討論

從滇重樓塊莖中分離得到98株內(nèi)生真菌，對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，其中有8株內(nèi)生真菌對(duì)供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用，菌株編號(hào)分別為PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73、PPC-78；內(nèi)生真菌發(fā)酵液初提物抑菌試驗(yàn)表明，3株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的提取物對(duì)供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他菌株的發(fā)酵液提取物對(duì)供試植物病原菌沒有抑制活性。

所用的植物病原菌僅包括土傳病害菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌，不能斷定除菌株P(guān)PC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73和PPC-78外的內(nèi)生菌沒有抑菌活性，應(yīng)繼續(xù)探索滇重樓內(nèi)生真菌對(duì)其他病原菌的抑菌活性，包括植物病原菌和動(dòng)物病原菌。

本研究?jī)H對(duì)部分菌株的發(fā)酵液提取物抑菌活性進(jìn)行研究，還應(yīng)對(duì)其他菌株的發(fā)酵液提取物的抑菌活性進(jìn)行研究；另外，本研究?jī)H采用乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液中的物質(zhì)進(jìn)行初步提取。下一步研究將圍繞內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定等方面進(jìn)行。

參考文獻(xiàn)：

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 [M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：183.

[2]李恒. 重樓屬植物[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998.

[3]張曉潔，查嶺生，陳小靜，等. 一株產(chǎn)重樓皂苷內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2006，33（5）：84-89.

[4]武珊珊，高文遠(yuǎn)，段宏泉，等. 重樓化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2004，35（3）：344-347.

[5]左予桐. 云南重樓抗腫瘤活性成分研究[D]. 天津：天津大學(xué)，2005.

[6]劉翔. 中藥重樓皂苷的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物轉(zhuǎn)化的研究[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2009.

[7]任安芝，高玉葆. 植物內(nèi)生真菌一類應(yīng)用前景廣闊的資源微生物[J ]. 微生物學(xué)通報(bào)，2001，28（6）：90-93.

[8]王麗萍，趙學(xué)偉. 云南重樓野生馴化及栽培技術(shù)研究初探[J]. 中國(guó)野生植物資源，2002，21（1）：62.

[9]牛燕芬，李揚(yáng)蘋，羅富成，等. 植物內(nèi)生真菌對(duì)寄主生長(zhǎng)及抗逆性的增效機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 草原與草坪，2015，35（2）：91-96.

[10]Kumar D，Schatz F，Moore R M，et al. The effects of thrombin and cytokines upon the biomechanics and remodeling of isolated amnion membrane in vitro[J]. Placenta，2011，32（3）：206-213.

[11]Mei C，F(xiàn)linn B S. The use of beneficial microbial endophytes for plant biomass and stress tolerance improvement[J]. Recent Patents Biotechnol，2010，4（1）：81-95.

[12]馬敏芝，南志標(biāo). 黑麥草內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌生長(zhǎng)的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2011，28（6）：962-968.

[13]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內(nèi)生細(xì)菌及其對(duì)入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：9-12.漆艷香，張賀，蒲金基，等. 芒果細(xì)菌性黑斑病病菌rep-PCR遺傳多樣性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：88-91.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.022