王孟虎+康廷國(guó)+許亮+楊燕云+蔡振嬌

[摘要] 哈蟆油具有較高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值，其混偽品較多，給市場(chǎng)造成了很大的混亂。利用基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)對(duì)已鑒定的東北林蛙、中國(guó)林蛙、桓仁林蛙和黑龍江林蛙進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，建立4種林蛙COI基因數(shù)據(jù)庫(kù)；將所測(cè)的序列與GenBank上的序列進(jìn)行比對(duì)，顯示為上述4種林蛙；應(yīng)用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）7.0軟件計(jì)算K2P遺傳距離并構(gòu)建NJ（neighbor-joining）系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，所測(cè)4種林蛙的序列和GenBank上下載的4種林蛙的序列分別聚為1支，但與GenBank上下載的2個(gè)外群獨(dú)立分開(kāi)，東北林蛙的COI基因可能存在地域性差異，但該技術(shù)并不能鑒別林蛙的雌雄。結(jié)果顯示DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定哈蟆油的基原動(dòng)物，說(shuō)明DNA條形碼COI為哈蟆油基原動(dòng)物的鑒定提供一個(gè)新的手段和方法。

[關(guān)鍵詞] 哈蟆油；東北林蛙；中國(guó)林蛙；DNA條形碼；鑒定

Identification of Ranae Oviductus original animal based on COI sequences

WANG Meng-hu，KANG Ting-guo*，XU Liang*，YANG Yan-yun，CAI Zhen-jiao

（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

[Abstract] Ranae Oviductus has a high economic and social value， but its adulterants are more numerous， which causes a great confusion to the market. Using DNA bar code technology based on COI sequence for PCR amplification and sequencing of the identified Rana dybowskii， R. chensinensis， R. huanrensis and R. amurensiss， the COI gene database of four species of Rana was established， and comparing the measured sequence with the sequence of GenBank， four kinds of Rana were identified. The MEGA （molecular evolutionary genetics analysis） 7 .0 software was used to calculate the genetic distance of K2P and construct the NJ （neighbor-joining） system cluster tree. The sequence of the four species of Rana measured were clustered into one group with the sequence of the four kinds of Rana downloaded from GenBank， but separated from the two outer groups downloaded from GenBank. The COI gene of the R. dybowskii was likely to have regional differences， however this technique failed to distinguish male and female Rana. The results showed that DNA bar code technology could accurately identify the base of original animal of R. oviductus. It indicates that DNA bar code COI provides a new method for the identification of R. oviductus.

[Keywords] Ranae Oviductus； Rana dybowskii； Rana chensinensis； DNA barcode； identify

哈蟆油作為名貴動(dòng)物藥及滋補(bǔ)品，其性平，味甘、咸，歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效[1]。哈蟆油作為遼藥六寶之一和遼寧特色的滿(mǎn)藥品種，其基原動(dòng)物主要分布在長(zhǎng)白山地區(qū)。過(guò)去在中國(guó)分布的林蛙命名比較混亂，各地區(qū)的林蛙命名經(jīng)過(guò)幾次變動(dòng)。自1985年版《中國(guó)藥典》至今記載哈蟆油的基原動(dòng)物為中國(guó)林蛙Rana temporaria chensinensis[1]，近年來(lái)部分學(xué)者認(rèn)為哈蟆油的基原動(dòng)物為東北林蛙R. dybowkii[2-7]，我課題組對(duì)哈蟆油的基原動(dòng)物進(jìn)行考證，認(rèn)為哈蟆油的基原動(dòng)物為東北林蛙。《四庫(kù)全書(shū)·盛京通志》記載“山蛤……多伏巖中，似蝦蟇而大，腹黃紅色，俗稱(chēng)哈什蟆……”；《遼海叢書(shū)·沈故篇》記載“哈什馬形似田雞，腹有油如粉條，有子如鮮蟹黃，取以作羹，味極肥美，然唯與京一帶有之。滿(mǎn)洲人用以祭祖，取其潔也

。”[8]根據(jù)上述記載，“盛京”、“興京”分別指今天的遼寧省沈陽(yáng)市、遼寧省新賓滿(mǎn)族自治縣，說(shuō)明哈蟆油的基原動(dòng)物分布在遼寧地區(qū)，現(xiàn)在遼寧新賓依然是哈蟆油的主產(chǎn)區(qū)之一。本實(shí)驗(yàn)收集長(zhǎng)白山地區(qū)的東北林蛙、桓仁林蛙和黑龍江林蛙與內(nèi)蒙古地區(qū)的中國(guó)林蛙，并鑒定為上述4種林蛙。提取4種林蛙的總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將所測(cè)序列與GenBank上的序列進(jìn)行比對(duì)。本實(shí)驗(yàn)首次利用DNA條形碼技術(shù)鑒定4種林蛙和對(duì)不同地域的東北林蛙進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定哈蟆油的基原動(dòng)物；東北林蛙線粒體COI基因的2個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)地域性的變異，該變異位點(diǎn)是否具有穩(wěn)定性需要進(jìn)一步研究。

1 材料

EPS-600型電泳儀，MG96G型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），Tanon-4100型凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems 公司），F(xiàn)resco17/21型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）。

Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，引物（北京天根生化科技有限公司），Trans 2K DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司），2×Taq MasterMix（北京康為試劑生物科技有限公司），瓊脂糖和溴化乙錠（EB）均購(gòu)自上海Sangon公司，其余均為分析純。

實(shí)驗(yàn)樣品及下載于GenBank的序列見(jiàn)表1，中國(guó)林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙均經(jīng)大連歷史博物館兩棲動(dòng)物研究員孫峰鑒定。

2 方法

2.1 DNA提取

用滅菌后的手術(shù)剪把樣品（肌肉）剪碎，加液氮研磨，取約20 mg樣品，使用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（生工）提取總DNA，具體操作步驟按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

2.2 PCR擴(kuò)增和電泳條件

引物為動(dòng)物COI基因通用引物[9-11]，包括正、反2個(gè)方向，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAA-TCA-3′。PCR反應(yīng)體積為50 μL，體系內(nèi)含Taq Master Mix 25 μL，引物對(duì)各2.0 μL（10 μmol·L-1），DNA提取液4 μL，加去RNA酶水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；94 ℃，40 s，35～42 ℃，1 min，72 ℃，1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，條件為100 V，230 mA，35 min。Marker采用寶生物（大連）DL 2000 Marker，Marker相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)從上至下為2 000，1 000，750，500，250，100 bp。

2.3 序列測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用 ABI 3730 XL 測(cè)序儀（華大基因公司）雙向測(cè)序，測(cè)序后得到正反兩向峰圖，利用Codoncode Aligner V 6.0.2[12]進(jìn)行峰圖的查看、拼接及比對(duì)。當(dāng)目的序列低于800 bp時(shí)，需去除拼接后的引物序列，但引物序列均在前30 bp和后30 bp的不穩(wěn)定區(qū)且拼接后的長(zhǎng)度也不相同，故在去除引物區(qū)這一步驟需手動(dòng)去除不穩(wěn)定的引物區(qū)。實(shí)驗(yàn)所測(cè)序列拼接后的序列長(zhǎng)度在690～710 bp，陳士林[13]用COI基因通用引物測(cè)得中國(guó)林蛙序列為658 bp，均低于800 bp，需手動(dòng)去除拼接后的引物區(qū)。對(duì)于從Genbank獲得的COI序列，采用Codoncode Aligner v 6.0.2軟件，與拼接好的樣品序列比對(duì)后，去除與樣品序列相對(duì)應(yīng)的658 bp以外的區(qū)段。所有序列應(yīng)用MEGA 7.0[14]軟件比對(duì)并計(jì)算K2P遺傳距離[15]、建立NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)[16]，在GenBank上進(jìn)行BLAST相似性搜索法[17-18]進(jìn)行序列的比對(duì)分析，驗(yàn)證各物種。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增

中國(guó)林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙進(jìn)行PCR時(shí)，中國(guó)林蛙退火溫度為42 ℃，電泳樣本10個(gè)，成功10個(gè)（1～10）；桓仁林蛙退火溫度為42 ℃，電泳樣本10個(gè)，成功各10個(gè)（11～20）；東北林蛙的退火溫度為37 ℃，電泳樣本75個(gè)，成功37個(gè)（21～57）；黑龍江林蛙的退火溫度為35 ℃，電泳樣本30個(gè)，成功2個(gè)（58～59）；以上所有成功的條帶均在500～750 bp出現(xiàn)亮帶。這表明，中國(guó)林蛙和桓仁林蛙DNA條形碼獲得條件通用，便于實(shí)踐中應(yīng)用，而東北林蛙和黑龍江林蛙不僅反應(yīng)條件獨(dú)特，而且成功率極低，分別為49%，6.7%，對(duì)于實(shí)踐應(yīng)用基本沒(méi)有參考價(jià)值，見(jiàn)圖1。

3.2 種內(nèi)和種間變異分析

3.2.1 中國(guó)林蛙 中國(guó)林蛙10條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，平均GC量為322，占48.9%。種內(nèi)最大K2P距離為0.002，種內(nèi)平均K2P距離為0.001。中國(guó)林蛙與桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙的種間遺傳距離分別為0.022，

0.085，0.107；種間分別有24，85，101個(gè)不同的堿基；種內(nèi)有1個(gè)變異位點(diǎn)，在第448位點(diǎn)有C/T變異，見(jiàn)圖2。

3.2.2 東北林蛙 東北林蛙37條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，平均GC量為325，占49.3%。種內(nèi)最大K2P距離為0.011，種內(nèi)平均K2P距離為0.003。東北林蛙與桓仁林蛙、黑龍江林蛙的種間遺傳距離分別為0.081，0.115；種間分別有81，108個(gè)不同的堿基，種內(nèi)有A/G，G/A，C/T，A/C等8個(gè)變異位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

3.2.3 桓仁林蛙 桓仁林蛙10條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，平均GC量為325，占49.4%，種內(nèi) K2P 距離為0.000?；溉柿滞芘c黑龍江林蛙的種間遺傳距離為0.102，種間有95個(gè)不同的堿基，種內(nèi)有無(wú)變異位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

3.2.4 黑龍江林蛙 黑龍江林蛙2條序列比對(duì)后序列長(zhǎng)度為658 bp，平均GC量為325，占49.4%。種內(nèi)K2P距離為0.000。種內(nèi)有無(wú)變異位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

3.3 NJ樹(shù)聚類(lèi)分析

利用MAGA 7.0軟件將所測(cè)序列與GenBank下載的序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，見(jiàn)圖3。4種林蛙的序列與勐臘水蛙和大綠臭蛙的序列分別聚為一支，從GenBank下載4種林蛙的序列與實(shí)驗(yàn)所測(cè)4種林蛙的序列分別聚為一支，說(shuō)明DNA條形碼技術(shù)不僅能夠鑒別4種林蛙，也能夠鑒定4種林蛙。東北林蛙和中國(guó)林蛙的雌雄個(gè)體并沒(méi)有聚為兩支而是聚在一支上，說(shuō)明DNA條形碼技術(shù)并不能鑒別林蛙的雌雄。遼寧（桓仁、清原）、吉林臨江和遼寧（鳳城、岫巖、寬甸）地區(qū)的東北林蛙分別聚為一支，上述東北林蛙COI基因序列在262，553位點(diǎn)分別有A/G，G/A變異且呈現(xiàn)地域性差異，說(shuō)明東北林蛙COI基因可能存在地域性變異。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)前期采用哈蟆油作為樣品，由于藥材遇水膨脹后呈黏糊狀[11]，利用SDS堿裂解法、苯酚法、試劑盒等方法均不能從哈蟆油中提取COI基因，故本次實(shí)驗(yàn)的所有樣品均來(lái)自林蛙的肌肉組織。

通過(guò)對(duì)中國(guó)林蛙種組（中國(guó)林蛙、東北林蛙）和黑龍江林蛙種組（黑龍江林蛙、桓仁林蛙）的4個(gè)物種59份樣品的COI基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，得到中國(guó)林蛙和桓仁林蛙的種間遺傳距離為0.022與東北林蛙和黑龍江林蛙的種間遺傳距離均大于0.080，說(shuō)明中國(guó)林蛙和桓仁林蛙的親緣關(guān)系更近，與傳統(tǒng)的林蛙分類(lèi)學(xué)將4種林蛙分為2個(gè)種組存在一定的矛盾。由于物種的基因更能說(shuō)明物種之間的親緣關(guān)系，DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物分類(lèi)學(xué)上的應(yīng)用有助于現(xiàn)代動(dòng)物分類(lèi)學(xué)更快的發(fā)展。

通過(guò)對(duì)3個(gè)省8個(gè)市的125份樣品提取總DNA并進(jìn)行PCR、測(cè)序，同一試劑盒對(duì)4種林蛙的提取成功率有很大的差別，中國(guó)林蛙和桓仁林蛙的PCR成功率為100%，東北林蛙PCR成功率為49.3%，黑龍江林蛙PCR成功率為6.7%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑龍江林蛙的PCR條件進(jìn)行多次優(yōu)化，其PCR成功率依然較低，應(yīng)考慮選擇不同的試劑盒進(jìn)行提取。線粒體COI基因位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，屬于母系遺傳，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)中國(guó)林蛙和東北林蛙的雌雄的COI基因進(jìn)行測(cè)序，其基因序列并不能鑒別林蛙的雌雄，驗(yàn)證了該理論。中國(guó)林蛙、桓仁林蛙、東北林蛙、黑龍江林蛙的種內(nèi)變異的個(gè)數(shù)分別為1，0，7，0個(gè)，說(shuō)明同一物種在同一地區(qū)其COI基因變異性較?。坏珫|北林蛙種內(nèi)的2個(gè)變異位點(diǎn)呈現(xiàn)地域性差異且本次實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)地域變異位點(diǎn)較為穩(wěn)定，遼寧岫巖、鳳城、寬甸聚為一支，遼寧桓仁、清原和吉林臨江聚為一支，可能是由于長(zhǎng)期的地理隔離，東北林蛙的線粒體COI基因發(fā)生了穩(wěn)定性的變異。對(duì)于不同地域的東北林蛙的堿基變異是否具有穩(wěn)定性，還需要進(jìn)一步研究。本次實(shí)驗(yàn)，基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確鑒定了哈蟆油基的原動(dòng)物，為鑒定哈蟆油基原動(dòng)物提供新的手段和方法。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]