□徐穎/廣元市農(nóng)業(yè)局

桑葚花色苷的提取、純化研究

□徐穎/廣元市農(nóng)業(yè)局

桑葚又名桑棗、桑果，屬于?？坡淙~喬木桑樹(shù)類(lèi)的成熟果實(shí)，味甜多汁，風(fēng)味獨(dú)特，是備受人們喜愛(ài)的水果之一。桑葚中含有各種人體所需營(yíng)養(yǎng)成分，比如維生素、氨基酸、礦物元素、黃酮類(lèi)物質(zhì)和多糖等，另外，桑葚中還含有非常豐富的桑葚紅色素，屬于花色苷類(lèi)成分，目前桑葚紅色素已經(jīng)被列入國(guó)家食品添加劑食用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760-2011）中，在48種天然色素中占有一席之位。天然色素是當(dāng)今世界發(fā)展的潮流。因此，提取桑葚中的天然色素，并將其應(yīng)用于食品加工等行業(yè)也是對(duì)桑葚資源開(kāi)發(fā)利用的重大趨勢(shì)之一。

花色苷易溶于極性溶劑中，因此常用的提取方法為溶劑萃取法，桑葚花色苷多采用酸性乙醇提取，但此方法容易使花色苷發(fā)生降解。而超聲波可以產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，一方面產(chǎn)熱來(lái)促進(jìn)溶質(zhì)的溶出，另一面增加溶質(zhì)與溶液間的接觸，從而能縮短提取時(shí)間、提高提取率。因此，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究超聲波輔助萃取法來(lái)提取桑葚中的花色苷，分別對(duì)影響提取率的4個(gè)條件因素進(jìn)行優(yōu)化比較，包括時(shí)間、料液比、乙醇濃度和超聲波功率，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)來(lái)確定提取桑葚花色苷的最佳條件。然后將得到的花色苷粗提物采用Amberlite XAD7HP型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，以此來(lái)得到高純度的花色苷純化物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干，重慶廣亞生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；4K-15臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；DF8517超低溫冰箱（韓國(guó)ilshin公司）；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Chist公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花色苷提取率的測(cè)定

總花色苷（以矢車(chē)菊花青素-3-葡萄糖苷計(jì)）含量用pH示差法進(jìn)行測(cè)定：吸取1 mL提取液，分別用2種不同的緩沖液將其稀釋到100 mL。第一種為pH=1.0的鹽酸-氯化鉀（0.025 mol/L）緩沖液，第二種為pH=4.5的醋酸-醋酸鈉（0.4 mol/L）緩沖液。搖勻后靜置15 min使其平衡后，分別測(cè)定其在520 nm和700 nm下的吸光度，以蒸餾水為空白。根據(jù)Wrolstad等人推導(dǎo)的公式計(jì)算花色苷提取率。

γ（mg/g）=（A×MW×DF）/（ε×L×SL）

A=（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5

式中：γ-花色苷提取率；

A-吸光度差值；

DF-稀釋倍數(shù)；

MW-矢車(chē)菊花青素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2）；

ε-矢車(chē)菊花青素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)（26 900）；

SL-提取工藝中的料液比；

L-標(biāo)準(zhǔn)光程（1 cm）。

1.2.2 花色苷提取試驗(yàn)

采用超聲波輔助酸化乙醇萃取法，原料為干桑葚，將其打成粉末狀，以供后續(xù)試驗(yàn)使用。稱(chēng)取一定量的桑葚粉，按一定濃度的酸化乙醇（0.1%HCl）、時(shí)間、超聲波功率和料液比進(jìn)行提取，將提取液冷凍離心（4℃，5 000 r/min，10 min），過(guò)濾，測(cè)定濾液吸光度，計(jì)算花色苷提取率，經(jīng)單因素正交試驗(yàn)確定最佳提取條件。將提取濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（45℃），得到花色苷粗提物濃縮液，將其倒入培養(yǎng)皿中，放置于-80℃冰箱，冷凍2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)將其冷凍干燥為桑葚花色苷粗提取物干粉。

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

1）不同時(shí)間對(duì)提取效果的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份質(zhì)量為5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，加入到75%酸化乙醇溶液中，在超聲波功率為160 W的條件下分別提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，離心、過(guò)濾之后測(cè)定花色苷提取率，通過(guò)比較提取率大小來(lái)確定較優(yōu)水平。

2）不同乙醇濃度對(duì)提取效果的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份質(zhì)量為5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，分別加入到濃度為45%、55%、65%、75%、85%的酸化乙醇溶液中，在超聲波功率為160 W的條件下提取30 min，離心、過(guò)濾之后測(cè)定花色苷提取率，通過(guò)比較提取率大小來(lái)確定較優(yōu)水平。

3）不同超聲波功率對(duì)提取效果的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份質(zhì)量為5.00 g的桑葚粉，按料液比1∶15，加入到75%酸化乙醇溶液中，分別在超聲波功率為100 W、120 W、140 W、160 W、180 W、200 W的條件下提取30 min，離心、過(guò)濾之后測(cè)定花色苷提取率，通過(guò)比較提取率大小來(lái)確定較優(yōu)水平。

4）不同料液比對(duì)提取效果的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取5份質(zhì)量為5.00 g的桑葚粉，料液比按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加入到濃度為75%的酸化乙醇溶液中，在超聲波功率為160 W的條件下提取30 min，離心、過(guò)濾之后測(cè)定花色苷提取率，通過(guò)比較提取率大小來(lái)確定較優(yōu)水平。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和超聲波功率這4個(gè)因素中的3個(gè)較優(yōu)水平，采用正交表L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以花色苷提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行方差分析，確定桑葚花色苷提取的最佳條件，并且對(duì)最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 花色苷分離純化試驗(yàn)

通過(guò)提取試驗(yàn)得到的桑葚花色苷粗提物含較多雜質(zhì)，其穩(wěn)定性、色價(jià)等各方面性質(zhì)較差，因此需要經(jīng)過(guò)分離純化以得到純度較高的花色苷純化物，國(guó)內(nèi)大多使用大孔樹(shù)脂對(duì)提取的花色苷進(jìn)行純化，本試驗(yàn)采用Amberlite XAD7HP型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花色苷粗提物進(jìn)行分離純化。

花色苷純化物得率=（桑葚花色苷純化物粉末質(zhì)量/桑葚干粉質(zhì)量）×100%

1.2.3.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

先將樹(shù)脂用蒸餾水沖洗5～6次，洗至上層蒸餾水澄清。過(guò)濾之后，用95%乙醇溶液浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法上柱，然后接著用95%乙醇溶液洗脫，直至流出液加適量水不會(huì)出現(xiàn)白色渾濁現(xiàn)象為止，再用蒸餾水洗脫直到無(wú)乙醇味即可。

1.2.3.2 花色苷純化物的制備

將提取工藝制得的桑葚花色苷粗提物粉末配制成10%水溶液，然后將其導(dǎo)入Amberlite XAD7HP型的大孔吸附樹(shù)脂柱中，以一定的流速進(jìn)樣，樹(shù)脂完全吸附花色苷后用上樣液20倍體積的酸化水（0.01%HCl）沖洗，以除去花色苷溶液中的可溶性雜質(zhì)，再用酸化乙醇（0.1%HCl、80%乙醇）溶液洗脫，當(dāng)從柱中流出的液體不透光時(shí)便用燒杯接入，直到液體開(kāi)始透光之后停止。將此溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（45℃），得到的濃縮液放置于-80℃冰箱，冷凍2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)將其冷凍干燥為桑葚花色苷純化物干粉。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 花色苷提取試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 時(shí)間對(duì)提取率的影響

在固定料液比1∶15，酸化乙醇濃度75%，超聲波功率160 W的條件下，提取不同時(shí)間后的花色苷提取率結(jié)果如圖1所示。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)花色苷提取率逐漸增大，并在40 min時(shí)達(dá)到最大，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)花色苷提取率開(kāi)始下降，說(shuō)明當(dāng)超生波提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)對(duì)花色苷提取造成損失。因此，選擇超聲波的提取時(shí)間為40 min。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

在固定料液比1∶15，超聲波功率160 W，分別在不同濃度酸化乙醇的條件下提取30 min后花色苷提取率結(jié)果如圖2所示。隨著酸化乙醇濃度的升高花色苷提取率逐漸增大，并在75%時(shí)達(dá)到最大，但此后隨著酸化乙醇濃度的升高花色苷提取率反而開(kāi)始下降，可能原因是高濃度的乙醇破壞了花色苷的結(jié)構(gòu)。因此，選擇酸化乙醇的濃度為75%。

2.1.3 超聲波功率對(duì)提取率的影響

在固定料液比1∶15，酸化乙醇濃度75%，分別在不同功率超聲波的條件下提取30 min后花色苷提取率結(jié)果如圖3所示。隨著超聲波功率的增大花色苷提取率逐漸增大，并在160 W時(shí)達(dá)到最大，此后隨著超聲波功率的增大花色苷提取率開(kāi)始下降，說(shuō)明當(dāng)超生波功率過(guò)大時(shí)會(huì)對(duì)花色苷提取造成損失。可能原因是大功率的超聲波會(huì)使提取過(guò)程中體系的溫度迅速上升，而高溫會(huì)破壞花色苷的結(jié)構(gòu)。另一方面在實(shí)際生產(chǎn)中，超聲波功率過(guò)大會(huì)使生產(chǎn)成本增加，這也不符合經(jīng)濟(jì)性原則。因此，綜合各方面的因素考慮，選擇超聲波功率為160 W。

圖1時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖2乙醇濃度對(duì)提取率的影響

圖3超聲波功率對(duì)提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

在固定酸化乙醇濃度為75%，超聲波功率160 W，分別在不同料液比條件下提取30 min，花色苷提取率結(jié)果如圖4所示。隨著料液比的減小花色苷的提取率逐漸增大，可能原因是當(dāng)料液比越小，乙醇溶液與桑葚粉的接觸面積便越大，因而使得更容易浸提出花色苷成分。但當(dāng)料液比低于1∶15時(shí)，料液比再減小對(duì)花色苷提取率的增加并沒(méi)有起到顯著作用，可能是在此條件下對(duì)花色苷的提取作用已經(jīng)接近極限，所以再增加溶劑的量也不會(huì)使提取率有明顯提高。因此，從節(jié)約成本等方面綜合考慮，選擇料液比為1∶15。

2.1.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定各因素水平的選擇范圍，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)方案，因素與水平設(shè)計(jì)如表1，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，由表中極差值可判斷各種因素對(duì)花色苷提取效果的影響大小順序?yàn)椋核峄掖紳舛龋?）＞料液比＞時(shí)間（min）＞超聲波功率（W），最優(yōu)組合為A2B3C2D2，即超聲波功率160 W，料液比1∶20，時(shí)間40 min，酸化乙醇濃度75%。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出結(jié)果花色苷提取率為15.129 2 mg/g，的確大于正交試驗(yàn)中得出的其他數(shù)值，由此可以判斷A2B3C2D2確實(shí)是最佳的提取條件。

2.2 花色苷純化物制備結(jié)果

在花色苷提取單因素和正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定最佳提取條件，準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量為70.00 g的桑葚粉，按料液比1∶20，加入到75%酸化乙醇溶液中，在超聲波功率為160 W的條件下分別提取40 min后，取出離心、過(guò)濾，將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制得花色苷粗提物濃縮液。得到的濃縮液放置于-80℃冰箱，冷凍2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，最后得到桑葚花色苷粗提物干粉，用pH示差法測(cè)得此粗提物的花色苷含量為3.14%。

將制得的桑葚花色苷粗提物干粉按照1.2.3的步驟進(jìn)行分離純化，最后制得花色苷純化物2.107 3 g，測(cè)得其花色苷含量為35.32%，計(jì)算得花色苷純化物得率即產(chǎn)品獲得率為3.01%。

圖4料液比對(duì)提取率的影響

表1正交試驗(yàn)因素與水平表

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超聲波輔助萃取法來(lái)提取桑葚中的花色苷，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定出了最佳的提取條件，即超聲波功率160 W，料液比1∶20，時(shí)間40 min，酸化乙醇濃度75%。而純化工藝?yán)玫氖茿mberlite XAD7HP型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花色苷的吸附作用，使得超聲波輔助萃取法制得的花色苷粗提物從花色苷含量為3.14%上升至35.32%，從而分離出純度較高的花色苷純化物。