王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015

利用SSR標記分析金觀音（半）同胞茶樹品種遺傳差異

王讓劍，楊軍，孔祥瑞，高香鳳

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015

準確鑒定無性系茶樹品種的遺傳差異是對其進行保護與利用的重要前提。實驗對金觀音同胞及半同胞茶樹品種的遺傳差異進行了分析，結(jié)果表明，參試的31個SSR標記分型結(jié)果具有高度的穩(wěn)定性。共擴增出117個等位位點，單個標記為2.0～8.0個，平均 3.77個?；蛐蛿?shù)為 2.0～11.0個，平均5.16個。基因多樣性指數(shù)范圍為0.15～0.80，平均0.54?；螂s合度范圍為0.17～0.94，平均0.61。引物多態(tài)信息含量范圍為0.14～0.77，平均0.48。引物鑒別力范圍為0.07～0.73，平均0.29。參試品種兩兩之間的遺傳距離變化范圍為0.10～0.52，平均0.35。遺傳多樣性大小順序為：同胞茶樹品種＜半同胞茶樹品種＜非同胞茶樹品種。利用系統(tǒng)發(fā)育樹可將參試茶樹品種分為5類，與茶樹品種的葉色、制茶特征分類結(jié)果基本一致。任意兩個品種同時在6個核心引物處（基因座）的基因型存在相同的可能性很低，為3.85×10-5，這組核心引物具有較高的鑒別力，可將參試茶樹品種完全鑒定。

茶樹；SSR；無性系品種；遺傳差異；指紋圖譜

茶樹品種是茶葉生產(chǎn)最基本、最重要的生產(chǎn)資料，也是茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。鐵觀音與黃棪是我國著名的兩個茶樹品種，課題組前期從鐵觀音與黃棪雜交后代中選育出超親優(yōu)勢或雜種優(yōu)勢強，融有兩親本優(yōu)異品質(zhì)性狀于一體，香氣、制優(yōu)率、產(chǎn)量、抗性與適應(yīng)性等性狀超過兩親本的金觀音、金牡丹、黃玫瑰等品種，以及金玫瑰、春桃香、紫觀音等品系[1-3]。利用該系列茶樹品種（系）制成的烏龍茶、紅茶均曾獲得“中茶杯”、“國飲杯”或“閩茶杯”的特等獎或金獎，其中金牡丹、黃玫瑰更被評為農(nóng)業(yè)部“九五”國家重點科技攻關(guān)計劃科技成果一級優(yōu)異種質(zhì)。

在眾多DNA分子標記中，SSR由于具有共顯性、位點豐富、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高等諸多優(yōu)點而備受青睞[4-5]。茶樹遺傳多樣性分析[6-8]、品種真實性鑒定[9-11]、遺傳圖譜構(gòu)建[12-13]等方面均有 SSR分子標記的廣泛應(yīng)用。福建是我國茶葉主產(chǎn)區(qū)之一，無性系茶樹品種推廣率高居全國第一，但近年隨著無性系茶樹品種的持續(xù)大面積推廣，品種混雜、近似品種難以辨認等現(xiàn)象逐漸突出。茶樹是異花授粉的多年生作物，遺傳基礎(chǔ)非常復(fù)雜，育種年限長達20年以上，品種選育是一項非常艱苦的工作。為保障生產(chǎn)用種與保護育種者知識產(chǎn)權(quán)，在分子水平上對重點推廣的茶樹品種進行遺傳差異分析與真實性鑒定具有重要的現(xiàn)實意義。金觀音同胞及半同胞茶樹品種適制性廣，制優(yōu)率高，制茶花香明顯，品質(zhì)優(yōu)異，倍受茶葉生產(chǎn)者、經(jīng)營者和消費者的歡迎，本研究利用SSR分子標記，開展金觀音同胞及半同胞茶樹品種遺傳差異分析與真實性鑒定，以期為該系列茶樹品種的保護與利用提供分子水平依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試材料為金觀音同胞與半同胞茶樹品種（系），以及鐵觀音、黃棪、本山3個對照種，如表1所示。相同材料不同單株重復(fù)取樣1次，樣品采集后用液氮迅速冷凍處理，保存在－70℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樹基因組DNA的提取

表1 參試材料Table 1 The tested materials

采用 CTAB法[14]按照生物學(xué)重復(fù)提取茶樹基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測，利用Biospec-nano（230 V）核酸蛋白分析儀進行定量，檢測DNA的純度與濃度。

1.2.2 引物合成

按照均勻分布的原則，在茶樹遺傳連鎖圖譜[12]上隨機選取45個SSR標記，以表1中的鐵觀音與黃棪人工雜交后代茶樹品種DNA為模板進行初篩，去除無多態(tài)性的引物14對（未列），剩余31對標記引物合成熒光引物，如表2所示。1.2.3 PCR擴增與產(chǎn)物檢測

反應(yīng)體系：ddH2O 16 μL，10×Buffer 3 μL，dNTP（10 mmol·L-1）3 μL，MgCl22 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL，Taq酶1 μL（0.5 U），模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性1 min，不同溫度條件退火1 min，72℃延伸1 min，重復(fù)35個熱循環(huán)；72℃延伸20 min，最后4℃保存。在96孔板內(nèi)加入1 μL DNA擴增樣品與10 μL ROX500分子量標準工作液，震蕩混勻，使用 Applied Biosystems 3730xlDNA分析儀檢測PCR擴增產(chǎn)物。PCR擴增、產(chǎn)物檢測均重復(fù)2次。

表2 參試SSR分子標記Table 2 SSR markers selected from 15 linkage groups of tea plant

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用PowerMarker軟件（v3.25）計算31對參試引物的遺傳參數(shù)，包括等位位點頻率、等位位點數(shù)、基因型數(shù)、觀測基因雜合度、引物多態(tài)性息含量，以及參試材料間的Nei′s遺傳距離。利用 MEGA軟件（V4.0）繪制參試茶樹品種系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)等位位點的頻率，計算各引物的PID值（Probability of identity, PID），PID值表示兩個隨機個體擁有相同基因型的概率，可以反映引物的鑒別力，PID值越大說明引物的鑒別力越小，PID值越小則說明引物的鑒別力越大，計算公式為：

PID=2（∑Pi2）2－∑Pi4，其中 Pi表示某個基因座第i個等位位點的頻率[15]。

1.2.5 核心引物篩選

為快速鑒別參試茶樹品種，在31對引物中篩選出 1組核心引物，篩選標準如下：①選擇長基序（Motif）引物，堿基數(shù)≥4；②引物多態(tài)信息含量豐富，PIC值＞0.5；③引物鑒別力較強，PID值＜參試的31對引物PID的平均值。

表3 黃棪品種重復(fù)實驗結(jié)果Table 3 The two independent detection results of Huang Dan

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析

[16]的方法，對檢測結(jié)果的原始數(shù)據(jù)進行標準化處理。由表3可知，標準化處理結(jié)果重復(fù)之間無差異，說明 SSR分型結(jié)果具有高度的穩(wěn)定性。

2.2 引物多態(tài)性分析

參試引物的各遺傳參數(shù)計算結(jié)果如表 4所示。31對引物共擴增出 117個等位位點，最多的為 8.00個（TM262），最少的為 2.00個（TM514、TM576、TM601），平均每對引物檢測到3.77個；基因型數(shù)最多的為11.0個（TM428、TM262），最少的為2.0個（TM576、TM601），平均每對引物檢測到5.16個；基因多樣性指數(shù)在0.15～0.80之間，平均為0.54；基因雜合度為 0.17～0.94，平均為 0.61；引物多態(tài)信息含量在0.14～0.77之間，平均為0.48；引物鑒別力在0.07～0.73之間，平均為0.29。參試品種的分型模式如圖 1所示，在TM324基因座處共有 3個等位位點即：171、177、183 bp，不同品種所包含的等位位點存在一定的差異。

表4 參試31個SSR標記主要遺傳參數(shù)Table 4 Key genetic statistics of the 31 tested SSR markers

2.3 遺傳差異分析

如表5所示，參試茶樹品種兩兩之間的遺傳距離變化范圍為0.10～0.52，平均0.35。遺傳距離最近的兩個品種是金觀音和紫觀音，最遠的兩個品種是春閨和鐵觀音，說明金觀音與紫觀音之間的遺傳差異最小，春閨與鐵觀音之間的遺傳差異最大。比較同胞茶樹品種、半同胞茶樹品種及非同胞茶樹品種之間的等位位點個數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)信息含量、遺傳距離可知，以上各指標均為同胞茶樹品種＜半同胞茶樹品種＜非同胞茶樹品種，說明同胞茶樹品種之間的遺傳多樣性最?。ū?）。

圖1 引物TM324對參試品種的分型模式圖Fig. 1 Fingerprinting mode of the tested cultivars characterized by TM324

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

參試材料之間的親緣關(guān)系可以通過系統(tǒng)發(fā)育樹直觀地體現(xiàn)出來。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果（圖2）表明，18個品種可以分為5類：第1類包括鐵觀音、鳳圓春、本山3個茶樹品種，葉色均為深綠，其中鳳圓春、本山所制烏龍茶品質(zhì)均酷似鐵觀音，滋味均具有鐵觀音的“音韻”特點，鳳圓春、本山畝產(chǎn)高于鐵觀音，比鐵觀音容易種植，3個品種均為晚生種；第2類包括黃玫瑰、黃觀音、黃棪、春閨、黃奇5個茶樹品種，葉色均為黃綠，所制烏龍茶品質(zhì)均具有黃棪的“透天香”特點，春茶新梢萌發(fā)期按早晚順序排列為：黃棪＞黃觀音=黃玫瑰＞黃奇＞春閨（“＞”表示“早于”，“=”表示“相當”，下同）；第3類包括紫牡丹、金牡丹、春桃香3個茶樹品種，葉色為深綠或綠，這類品種制烏龍茶均具有明顯的“花果香”，且制優(yōu)率高，畝產(chǎn)均高于鐵觀音，春茶新梢萌發(fā)期按早晚順序為：金牡丹＞春桃香＞紫牡丹；第4類包括春蘭、瑞香2個品種，葉色均為黃綠，制烏龍茶具有“蘭花香”，畝產(chǎn)高于鐵觀音，春茶新梢萌發(fā)期春蘭早于瑞香；第5類包括金桂觀音、金玫瑰、紫觀音、金觀音、紫玫瑰5個品種，葉色均為深綠，這類品種制烏龍茶香氣馥郁悠長，“韻味”顯，畝產(chǎn)均高于鐵觀音，春茶新梢萌發(fā)期按早晚順序為：金玫瑰＞金觀音＞紫玫瑰＞金桂觀音＞紫觀音。系統(tǒng)發(fā)育樹分類結(jié)果與茶樹品種的葉色、制茶特征分類結(jié)果基本一致。

表5 參試材料遺傳距離Table 5 Genetic distance of the tested cultivars based on SSR markers

2.5 核心引物篩選與參試品種快速鑒定

按上述篩選標準，從 31對參試引物中進一步篩選出6對核心引物，如表7所示。假設(shè)每個位點都是獨立遺傳的，根據(jù)引物的PID值，理論上可以計算出利用6對核心引物同時進行參試茶樹品種鑒定，任意兩個品種的基因型存在相同的可能性為3.85×10-5，即每100 000個品種中有 3.85個品種具有相同的基因型，說明這組核心引物具有較高的鑒別力。按照核心引物 PID值由小到大的順序排列，只需利用TM440、TM348、TM241作為首選引物組合即可將參試材料快速鑒別出來，其余3對核心引物TM324、TM569、TM461可以作為補充引物進行補充鑒定。

3 討論

熒光標記電泳檢測方法通過與內(nèi)標比較，依據(jù)待檢樣品目標峰的位置，即可直接讀出DNA片段大小，具有良好的準確性，但部分SSR標記易產(chǎn)生等位位點“漂移”（Allelic drift），擴增片段大小與實際等位位點大小產(chǎn)生±2.1 bp的波動[17]，此時應(yīng)對照SSR標記重復(fù)基序（motif）堿基個數(shù)對原始數(shù)據(jù)進行糾偏及標準化處理。本實驗參試引物中，TM445、TM569、TM461、TM262、TM348、TM351的擴增結(jié)果均產(chǎn)生不同程度的“漂移”，但標準化后重復(fù)實驗間無差異，確保了SSR標記分型數(shù)據(jù)的準確性。

圖2 參試無性系茶樹品種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogeny tree of the tested clonal tea cultivars

利用 SSR分子標記進行品種遺傳差異分析及真實性鑒定，引物的篩選是重點，本實驗在引物篩選方面進行了較充分的考慮。首先，初選31個SSR引物覆蓋了茶樹15個連鎖群，確保了遺傳差異分析具有一定的代表性，從系統(tǒng)發(fā)育樹分類結(jié)果也可以看出基于31個參試SSR標記的分類結(jié)果與茶樹品種的葉色、制茶特征分類結(jié)果基本一致，推測參試 SSR標記可能與葉色和制茶特征性狀具有較高的關(guān)聯(lián)性；其次，核心引物均為長基序引物，基序堿基數(shù)均大于4，不受等位位點“漂移”的影響，相鄰的等位位點容易鑒別，讀取的電泳數(shù)據(jù)更可靠，更適宜用來進行品種的真實性鑒定；第三，核心引物PIC值均大于0.5，PID值均小于全部參試引物的平均數(shù)，具有較高的多態(tài)性和鑒別力，能夠利用盡量少的引物鑒定盡量多的品種，可以降低鑒定成本和提高鑒定效率。

鐵觀音與黃棪品種歷史悠久，享譽國內(nèi)外，但由于歷史原因，在苗木繁育過程中產(chǎn)生了人為或本身遺傳變異的混雜，尤以鐵觀音混雜更甚，嚴重影響了其茶葉的品質(zhì)[18]。從表6可知，鐵觀音與黃棪的人工雜交后代品種在TM440、TM348、TM461 3個基因座處均產(chǎn)生了非父母本來源的等位位點，如：TM440處的“160”與“170”、TM348處的“248”、TM461處的“204”，而鐵觀音的近親本山品種恰恰在TM440基因座上擁有“160”位點，在TM348處擁有“248”位點，這說明參試的鐵觀音與金觀音等同胞茶樹品種真正的母本存在一定的差異，這也從分子水平上揭示了現(xiàn)存鐵觀音品種的混雜現(xiàn)象。

雖然金觀音同胞茶樹品種的遺傳多樣性受兩親本的局限，其遺傳多樣性低于半同胞及非同胞茶樹品種，但多年的田間試驗及生產(chǎn)實踐均表明，金觀音（半）同胞茶樹品種香氣、制優(yōu)率、產(chǎn)量、抗性與適應(yīng)性等性狀超過兩親本，已融有兩親本的優(yōu)異性狀，推測其中可能包含大量有利的等位基因資源，因此金觀音（半）同胞茶樹品種除繼續(xù)在生產(chǎn)上發(fā)揮作用，亦可作為優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源用于茶樹品種選育。因人工選擇而導(dǎo)致品種多樣性降低，是作物品種改良中的共性問題[19-20]，今后在茶樹育種過程中應(yīng)更加重視茶樹種質(zhì)資源的收集、保護、鑒定工作，加強種質(zhì)資源創(chuàng)新，為育種不斷提供新基因源，同時積極探索并開展分子標記輔助選擇育種，縮短育種年限。

表7 參試茶樹品種6對核心引物的基因型Table 7 Genotyping results of 18 cultivars by six core primer pairs

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Genetic Analysis of Full- and Half-sib Families of Tea Cultivar Jinguanyin Based on SSR Molecular Markers

WANG Rangjian, YANG Jun, KONG Xiangrui, GAO Xiangfeng

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Science, Fujian Branch, National Center for Tea Improvement, Fu′an 355015, China

Accurate identification of the genetic differences among tea cultivars is the prerequisite for conservation and utilization. Genetic differences of the full- and half-sib families of tea cultivar Jinguanyin were analyzed based on SSR molecular markers. The results showed that the genotyping data of the tested 31 SSR markers were highly stable, with totally 117 alleles and averagely 3.77 alleles per marker (ranging from 2 to 8). The number of genotypes, gene diversity index, gene heterozygosity, polymorphism information content (PIC) and discrimination power (PID), genetic distance ranged from 2 to 11, 0.15 to 0.8, 0.17 to 0.94, 0.14 to 0.77, 0.07 to 0.73 and 0.10 to 0.52, averagely 5.16, 0.54, 0.61, 0.48, 0.29 and 0.35, respectively. The genetic diversity followed the order that full-sib tea cultivars＜ half-sib tea cultivars ＜ non-sib tea cultivars. The tested tea cultivars could be divided into 5 categories by the phylogenetic tree, which was closely correlated with leaf colour and tea manufacture characteristics. It’s a low probability (3.85×10?5) to identify the wrong cultivar using 6 core SSR markers, which were highly accurate in identification and could be used for fingerprinting analysis in the tested clonal tea cultivars.

tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze], SSR, clonal tea cultivar, genetic differences, fingerprinting

S571.1；Q52

A

1000-369X（2017）02-139-10

2016-09-29

2016-12-05

福建省自然科學(xué)基金（2015J01098）、福建省省屬公益類科研院所基本科研專項（2014R1012-3、2014R1012-6）

王讓劍，男，助理研究員，主要從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究，E-mail: rangjian.wang@163.com