謝典佑

[摘要]作為體外合成蛋白表達手段的一種，無細胞蛋白表達體系有著蛋白合成高效快速、反應操縱簡便等方面的優(yōu)點，在基礎生物學領域的研究中有著廣泛的應用價值。無細胞蛋白表達體系目前已成功應用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。高通量藥物篩選等領域，為解決生物制藥領域中的難題提供了新的解決思路。同時，經(jīng)過研究人員的不斷努力，對其在生物制藥工程中的應用也取得了新的研究進展，顯示出重要的應用潛能。本文基于對無細胞蛋白表達體系的闡述和分析，對其在生物制藥工程中的應用做出了相關的探討和研究，以期能為生物制藥領域的發(fā)展提供一定的技術支撐和借鑒。

[關鍵詞]生物：制藥工程；無細胞蛋白；表達體系；應用

隨著生物科學技術的發(fā)展，人們對蛋白質組學相關的前沿領域的研究越來越關注，無細胞蛋白表達體系（cell-free protein synthesis，CFPS）也因此備受重視。尤其是近些年來，無細胞蛋白表達體系的研究已逐漸從原核深入到真核的反應體系，成本不斷降低。較之于傳統(tǒng)的體內表達體系，無細胞蛋白表達體系基于細胞提取物，有著不受細胞的生理限制以及胞內蛋白酶的降解、可以在較短的時間內進行大量的毒性蛋白表達、無需繁雜的下游處理以及產(chǎn)物的活性增加等諸多方面的應用優(yōu)勢。同時，其在生物制藥中也逐漸體現(xiàn)出了毒性蛋白、復雜蛋白以及膜蛋白表達等方面的優(yōu)勢。但由于天然蛋白水溶性差、半衰期短等因素的影響，如何實現(xiàn)重組蛋白的穩(wěn)定表達，發(fā)揮無細胞蛋白表達體系在醫(yī)療方面的應用潛力，就成為生物制藥領域的重要研究課題。因此，本文討論和研究無細胞蛋白表達系統(tǒng)在生物制藥工程中的有效應用問題，將對更好地實現(xiàn)該系統(tǒng)在制藥科學領域應用潛力的發(fā)揮有著重要的理論和現(xiàn)實意義。

1.無細胞蛋白表達體系概述

作為一種生物學技術，傳統(tǒng)的蛋白表達是基于細胞體內，對動植物細胞以及細菌等外源基因的表達。而無細胞蛋白合成系統(tǒng)是一種全新的蛋白合成方式，實現(xiàn)了以外源DNA或mRNA為模板，利用細胞抽取物中的蛋白因子、相關的酶系等，通過在體系內加入ATP、GTP以及氨基酸、能量再生物質等來實現(xiàn)蛋白表達的體外系統(tǒng)（如圖1所示）。自1982年世界上第一個重組蛋白藥物胰島素問世以來，重組蛋白藥物由于來源廣泛，且有著較高的安全性在短短幾十年時間就實現(xiàn)了在生物制藥領域的飛速發(fā)展，在全球藥物市場上越來越占據(jù)著舉足輕重的地位。表達重組蛋白藥物最常用的系統(tǒng)包括大腸桿菌、釀酒酵母以及中國的倉鼠卵巢細胞。但諸如此類的體內表達系統(tǒng)往往由于種種原因而導致一些復雜蛋白不能順利表達，在這一迫切需求下，無細胞蛋白表達技術便應運而生。

隨著國內外學者對蛋白合成技術的深入研究以及蛋白連續(xù)翻譯系統(tǒng)的建立，無細胞表達也有了突破性的研究，實現(xiàn)了蛋白的連續(xù)表達。該系統(tǒng)無需在活體細胞內進行，基于細胞提取物就可以實現(xiàn)連續(xù)的轉錄和翻譯，從而快速高效合成目標蛋白。該系統(tǒng)沒有細胞壁，也不必關注維持活體細胞生命的相關生化反應，在表達技術上占據(jù)獨特的優(yōu)勢。同時，蛋白合成的條件相對容易調整，有助于蛋白的表達和折疊。依據(jù)這一優(yōu)勢，無細胞蛋白表達體系在生物制藥工程中也較多適用于快速表達醫(yī)用蛋白、高通量蛋白庫篩選等復雜蛋白質的合成。該系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是表達具有毒性的蛋白，由于無需維持宿主細胞的活性，也更容易地實現(xiàn)插入非天然氨基酸的表達，可較好地被用于研究蛋白的化學特性中。因此，隨著近些年來對該系統(tǒng)相關應用研究的不斷深入，已經(jīng)逐漸實現(xiàn)了在生物制藥相關領域的廣泛應用，如進行多肽類藥物、腫瘤疫苗、重組蛋白藥物等大規(guī)模的生產(chǎn)以及高通量藥物的篩選等。

2.無細胞蛋白表達體系的分類

就目前來講，已開發(fā)出來的無細胞蛋白表達系統(tǒng)主要包括原核和真核兩種表達系統(tǒng)類型。兩者由于表達系統(tǒng)的不同，也存在著不同的特點，在實際科學生產(chǎn)研究的過程中需要根據(jù)不同的需求進行兩種表達系統(tǒng)的恰當選擇。

2.1原核系統(tǒng)

對原核表達系統(tǒng)的研究由來已久，該系統(tǒng)實現(xiàn)目標蛋白的表達是利用的原核生物細胞提取物，最為常見的是大腸桿菌。由于其具有較強的耐受性，因此在此基礎上建立無細胞蛋白表達系統(tǒng)就具有獨特的優(yōu)勢。人們在具體進行目標蛋白的表達中，可以根據(jù)需要加入蛋白酶抑制劑以及標記蛋白等特殊添加劑，在含有雜質的情況下依舊可以進行目標蛋白的表達。其不足之處在于在進行蛋白的翻譯加工后，在正確折疊方面現(xiàn)階段仍是較大的困難。不過由于大腸桿菌材料來源廣泛，成本較低，也存在著較高的表達效率，因此在體外表達系統(tǒng)研究中仍是較為熱門的話題。

2.2真核系統(tǒng)

真核表達系統(tǒng)是與原核表達相對應的系統(tǒng)，其進行目標蛋白的表達，利用的是真核生物細胞提取物。其中，最為常見的就是麥芽提取物和兔網(wǎng)織紅細胞裂解液。與上述表達系統(tǒng)不同的是，真核細胞表達系統(tǒng)不存在基因的非特異性激活或者抑制，因此能夠實現(xiàn)對調控基因的高效表達。在該表達系統(tǒng)中，為保證得到性質相對穩(wěn)定的蛋白質，實現(xiàn)真核細胞基因組的整合，也常需要將環(huán)狀的模板線性化，以保證合成效率不斷加強。經(jīng)過相關學者的實踐研究證實了，大腸桿菌以及麥芽提取物系統(tǒng)都有著較高的合成量，能夠進行高通量的蛋白質組學研究。

3.在生物制藥工程中的應用

無細胞蛋白表達體系長時間以來由于生產(chǎn)效率低下、成本高昂等缺點的限制，在生物學領域的研究較廣。隨著生物技術的進步，相關的能量再生系統(tǒng)以及細胞提取物制備工藝等近些年來逐漸得以深入的研究和不斷優(yōu)化，實現(xiàn)了蛋白的體外高通量表達，并有效拓展了無細胞蛋白表達系統(tǒng)的應用領域。尤其是在生物制藥領域，該系統(tǒng)有著重要的應用潛力，為實現(xiàn)生物制藥諸多問題的解決提供了新的解決思路。以下是筆者根據(jù)自身所學，總結出的無細胞蛋白表達系統(tǒng)在生物制藥工程中進行重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)、非天然氨基酸的引入以及蛋白的高通量表達等方面的具體應用。

3.1引入非天然氨基酸

進行蛋白工程改性的重要途徑就是將非天然氨基酸引入蛋白序列，以為蛋白質進行化學修飾提供額外的基因。在早期的無細胞蛋白表達體系中，通過加入抑制性tRNA以識別特定終止密碼子的氨?；?，并以攜帶特定位點無義突變的基因作為模板，在目標蛋白的特定位點引入非天然氨基酸（見圖2）。相關的研究人員在此基礎上發(fā)現(xiàn)了更為有效的編碼非天然氨基酸技術，并成功實現(xiàn)了在蛋白藥物進行特異性修飾中的應用，賦予了非天然氨基酸以獨特的藥理特性，如延長半衰期以及提高了藥代動力學穩(wěn)定性等。在現(xiàn)階段的研究中，通過在無細胞蛋白表達體系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反應體系，能夠對目標蛋白進行選擇性的修飾。如國外研究者Zimmerman等現(xiàn)已研發(fā)出新型的抗腫瘤藥物等?？傊?，由于這一方面的優(yōu)勢，該體系在升級蛋白藥物領域以及開發(fā)新型蛋白藥物中有著廣闊的應用前景。

3.2重組蛋白藥物的大規(guī)模生產(chǎn)

隨著相關科學家研究的不斷深入和優(yōu)化，近些年來無細胞蛋白表達技術已日趨成熟，能夠成功開發(fā)出反應時間更長、體積更大且生產(chǎn)效率更高的體外蛋白合成系統(tǒng)。除此以外，無細胞蛋白表達體系的優(yōu)勢還表現(xiàn)在蛋白活性以及下游純化工藝等方面，推進了在重組蛋白藥物生產(chǎn)領域中應用該系統(tǒng)的更深層次的研究和發(fā)展。無細胞蛋白表達系統(tǒng)的常用來源為大腸桿菌，除此以外對上述的真核系統(tǒng)為來源的表達體系也逐漸被得以進一步開發(fā)，在更加復雜結構的膜蛋白以及翻譯后的修飾中得以開發(fā)生產(chǎn)。在這一方面國外學者Brodel等有了新的研究進展，其建立了一套新型的哺乳動物無細胞蛋白表達體系，在促進蛋白正確折疊、表達復雜蛋白方面占據(jù)著優(yōu)勢地位。并且在這一系統(tǒng)下，他們已實現(xiàn)了在體外進行人促紅細胞生成素和螢火蟲熒光素酶的成功表達，并實現(xiàn)了對其進行糖基化修飾，有著里程碑的研究意義。其研究結果也證實了，無細胞蛋白表達技術在重組蛋白藥物中，有著較好的大規(guī)模生產(chǎn)的應用前景。

3.3蛋白的高通量表達

實現(xiàn)基因編碼的蛋白質之間的相互作用關系以及結構功能的系統(tǒng)闡明，成為后基因組時代科學家面臨的重大難題之一。在這一背景下，建立相對高效的高通量蛋白表達技術就有著十分重要的現(xiàn)實意義。而無細胞蛋白表達體系由于其自身獨特的優(yōu)勢，在近些年來的科學研究中倍受青睞。較之傳統(tǒng)的體內表達體系，無細胞蛋白表達體系省去了對分子的克隆過程，可直接使用PCR片段作為模板。對于一些很難在體內進行系統(tǒng)表達的復雜蛋白，也能夠實現(xiàn)在無細胞蛋白表達系統(tǒng)中的正確折疊。利用這些優(yōu)勢，研究人員在進行體外蛋白質組學的研究過程中，就有了一個更加靈活的研究手段。除此以外，該系統(tǒng)的優(yōu)勢還在于能夠進行高效便捷的制備蛋白芯片。利用無細胞蛋白表達體系能夠一步法實現(xiàn)蛋白的固定化，無需在進行大量可溶性蛋白的純化，從而省去了高昂的成本費用以及蛋白的表達與純化過程，有著較為靈活的過程和特點。現(xiàn)階段經(jīng)過大量的實驗研究，蛋白芯片技術已逐漸能夠在臨床診斷以及對有毒物質的檢測中進行有效地應用，如對代謝類疾病、癌癥以及免疫的診斷等?？傊?，無細胞蛋白表達體系在蛋白制備技術以及高通量蛋白表達中的成功應用和快速發(fā)展，也促進了其在新藥發(fā)現(xiàn)、疫苗研發(fā)以及疾病診斷等諸多領域的廣泛應用。

綜上所述，作為一種快速高效的體外蛋白合成手段，無細胞蛋白表達體系較之傳統(tǒng)的體內表達，能夠有效彌補其不足，實現(xiàn)了復雜蛋白在體外的順利表達，因此在生物制藥領域中有著廣闊的應用前景。當然，在現(xiàn)階段的無細胞蛋白表達體系中的研究中也仍然存在一定的不足之處，要實現(xiàn)其在生物制藥工程中更為廣泛的應用，還需要相關的研究人員不斷優(yōu)化和研究其反應體系，充分挖掘體外合成系統(tǒng)的應用潛力，更好地推進我國生物制藥工程的發(fā)展。