雷燕，張湘娥，敬霖志

（1.海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司研發(fā)部，海南?？?70105；2.蘇州昊德生物科技有限公司，江蘇蘇州215123）

酸水解法測定保健酒中的總皂苷含量

雷燕1，張湘娥1，敬霖志2

（1.海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司研發(fā)部，海南?？?70105；2.蘇州昊德生物科技有限公司，江蘇蘇州215123）

為了開發(fā)測定保健酒中總皂苷含量更準確的分析方法，將保健酒中皂苷用反相固相萃取法從酒體中分離出來；所得的皂苷提取物用酸水解后，再用溶劑萃取得到苷元；最后用香草醛-硫酸比色法，以人參皂苷Re為標準，測定總苷元含量。結(jié)果表明，人參皂苷元（Re）在6.8～91μg/m L范圍線性關(guān)系良好，y= 0.011x+0.012（R2=0.999），平均加標回收率為99.15%，RSD值為1.91%，精密度、重復性良好。皂苷經(jīng)水解后消除了糖基對香草醛顯色劑的干擾，提取苷元過程采用液液萃取的方式可將保健酒A中的色素完全除去。方法穩(wěn)定，可作為保健酒中總皂苷的檢測及其活性中藥成分含量的質(zhì)量控制的檢測方法。

保健酒；總皂苷；苷元；香草醛-硫酸顯色

保健酒（Liqueurs）是由基酒加中藥配制而成，具有抗疲勞，調(diào)節(jié)免疫力之功效。保健酒將中藥功能與酒的作用有效結(jié)合，極大地增強了藥物的效能與作用，藥借酒勢，酒助藥威，迅速增強人體微循環(huán)（擴張毛細血管），使有效成分直達病灶，諸多癥狀可迅速得到緩解或消失。保健酒的生物活性成分通常來自傳統(tǒng)中藥，特別是有滋補作用的中藥?？傇碥占礊楸＝【浦兄匾墓πС煞?，“皂苷”是由甾體或三萜類化合物作為苷元與糖分子縮合而成的一類低聚糖苷[1-2]，是一類廣泛存在于植物細胞內(nèi)的有機化合物，它具有調(diào)節(jié)腎臟功能，抗缺氧和抗疲勞、抗低溫應(yīng)激作用、抗脂質(zhì)氧化作用、抗致突變作用及雙向調(diào)節(jié)免疫的保健功能[3]。

總皂苷的現(xiàn)有檢測標準為2003版《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》，該法是針對保健食品中“總皂苷”含量測定的一個廣泛方法。皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基本身可與香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，保健酒中含有多種不同糖基數(shù)的皂苷致使與香草醛出現(xiàn)顯色結(jié)果差異。為消除糖基對香草醛顯色劑的干擾，本研究在衛(wèi)生部方法[4]的基礎(chǔ)上將保健酒中皂苷水解成不含有糖基的苷元[5-6]再與硫酸-香草醛顯色[7]，從而達到準確檢測保健酒樣中總皂苷含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

供試品與對照品：保健酒A，海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司提供；人參皂苷Re，中國藥品生物制品檢定所。

儀器設(shè)備：萊伯泰科UV2000型紫外分光光度計；十萬分之一分析天平（Mettler Toledo XS205DU）；萬分之一天平（Mettler Toledo AL204-IC）；漩渦混懸器（VELPZX3）；固相萃取儀（supelco 12管路）；隔膜真空泵（Ameritech AVP-7120）；氮吹儀（上海安譜DC-12）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技R-201）。移液槍；塑料離心管；50m L圓底燒瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18OH，500mg 3m L，50/ PK，Agilent Technologies)。

試劑耗材：香草醛（基準試劑）二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、鹽酸為分析純；77%硫酸溶液（v/v）；氯化氫水溶液（4mol/L）；70%甲醇水溶液（v/v）。

香蘭素硫酸顯色中間液：準確吸取8%香蘭素甲醇溶液500μL加入3000μL的77%硫酸溶液中，振蕩混合均勻，冷卻至室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

1.2.1.1 皂苷苷元溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re適量，用甲醇定容，配制成人參皂苷Re對照品溶液（4mg/m L），精密移取500μL的乙腈于塑料離心管中，加入鹽酸（4mol/L）500μL，渦旋混勻得到水解溶劑，再往其中加入4 mg/L的Re對照品溶液1 m L，渦旋混勻后放入80℃恒溫水浴3 h，冷卻后加入5m L的二氯甲烷和3m L的去離子水，有機相用3m L水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2m L乙腈溶解，得到濃度為1.0mg/m L的人參皂苷苷元溶液。

1.2.1.2 苷元標準曲線工作溶液

分別準確吸取苷元溶液（1.0 mg/m L）75μL、 150μL、300μL、600μL于刻度試管中，用乙腈定容至1m L，渦旋混勻，得到濃度為0.075mg/m L、0.15mg/m L、0.30mg/m L、0.60mg/m L的苷元標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.3 顯色

分別準確吸取濃度為0.075mg/m L、0.15mg/m L、0.30mg/m L、0.60mg/m L的苷元標準曲線工作溶液500.0μL加入到4.5m L的香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，同時吸取500.0μL的乙腈按照上述步驟操作，得到溶劑空白顯色組。所得混合物于70℃水浴加熱10m in后迅速放入冰水中冷卻30 s，檢測溶液在541 nm（掃描最大吸收波長）波長下的吸光度,每個樣品平行測定3次。

1.2.2 供試品溶液的制備

1.2.2.1 皂苷提取

準確吸取1.0m L保健酒A于瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，所得固體用1.0 m L水溶解，備用。將此樣品溶液加入經(jīng)激活的萃取小柱中，然后用6m L去離子水洗滌，保持1～2滴/s的速度除去樣品中的糖類物質(zhì)。再分別用70%甲醇水溶液（6m L）和甲醇(10 m L)進行洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去甲醇和水，所得固體用甲醇1.0 m L溶解備用。

1.2.2.2 水解

精密移取500μL的乙腈于15m L塑料離心管中，加入鹽酸500μL，渦旋混勻得到水解溶劑，加入上述酒樣甲醇溶液1m L，渦旋混勻后放入80℃恒溫水浴3 h，冷卻至室溫后加入5m L的二氯甲烷和3m L的去離子水，有機相用3m L水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2m L乙腈溶解得到酒樣水解的苷元溶液。

1.2.2.3 顯色

分別準確吸取500.0μL酒樣苷元乙腈溶液加入到4.5m L的香草醛-硫酸顯色中間溶液中，混合均勻，所得混合物于70℃水浴中加熱10min后，迅速放入冰水中冷卻30 s，上機測定吸光度，每個樣品平行測定2次。

1.2.2.4 計算

式中：X——酒樣中總皂苷的含量，mg/100m L；

A標——紫外分光光度計測定的校準溶液的吸光度值；

A樣——紫外分光光度計測定的樣品吸光度值；

C標——顯色體系中校準溶液的濃度，μg/m L；

946.55 ——人參皂苷Re的摩爾分子量，g/mol；

476.73 ——人參皂苷水解成苷元的摩爾分子量，g/ mol；

V1——酒樣溶液的配制過程中酒樣苷元乙腈溶液的定容體積，m L；

V2——測定吸光度過程中吸取酒樣苷元乙腈溶液的體積，m L；

V3——測定吸光度過程中香草醛硫酸顯色中間溶液的體積，m L。

2 方法學驗證

2.1 線性關(guān)系考察

以1.2.1.3中苷元標準曲線工作溶液顯色體系中的濃度（7.5μg/m L、15μg/m L、30.0μg/m L、60.0μg/m L、100.0μg/m L）為橫坐標（X），測定的吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

2.2 精密度考察

精密吸取0.15 mg/m L的皂苷苷元溶液500.0μL，按照1.2.2.3步驟操作顯色并測定吸光度(顯色液中苷元濃度為15μg/m L)，重復測定6次，測定RSD值。

2.3 重復性考察

取試樣1.0 m L酒樣，按照1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3前處理及顯色步驟平行處理6份測定吸光度，測定RSD值。

2.4 穩(wěn)定性考察

精密吸取0.15mg/m L的皂苷苷元標準曲線工作溶液500.0μL按照1.2.2.3步驟操作顯色，在指定時間間隔下（30 m in）觀察吸光度值的變化，測定RSD值。

2.5 加標回收實驗

取保健酒樣A 1.0 m L，按照1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3步驟操作，測定保健酒中總皂苷的含量。精確吸取人參皂苷Re標準溶液（3.6mg/m L）1.5m L于10m L的容量瓶中，用保健酒A定容至刻度。精確吸取上述加標樣品1m L，平行做3份于100m L的瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，用1m L去離子水溶解，按照1.2.2.1、1.2.2.2提取、水解，再精確吸取500μL上述加標酒樣苷元乙腈溶液2份按照1.2.2.3顯色測定，平行測定3次，測定加標樣品的總皂苷含量并計算加標回收率。

3 方法可行性分析

3.1 線性關(guān)系的考察

實驗結(jié)果表明，人參皂苷苷元的濃度在7.5～100.0μg/m L之間呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為y=0.011x+0.012，R2為0.999。

3.2 精密度考察（圖1、表1）

圖1 人參皂苷苷元標準曲線

表1 精密度實驗結(jié)果(n=6)

由表1可知，6次測定的RSD值為0.579%，說明酸水解皂苷顯色法測定皂苷含量的精密度良好。

3.3 加標回收實驗（表2）

由表2加標回收實驗結(jié)果可知，加標樣品平行處理6份，測定平均加標回收率為99.15%，RSD值為1.91%，說明酸水解皂苷顯色法測定皂苷含量的準確度較好。

3.4 重復性考察（表3）

由表3可知，平行處理6份樣品測定皂苷含量，RSD值為2.25%，說明酸水解皂苷顯色法測定總皂苷含量的方法重復性較好。

3.5 穩(wěn)定性考察（表4）

由表4可知，供試樣品10次測定吸光度值的RSD值為0.634%，說明供試樣品在0.5 h內(nèi)較穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果(n=10)

4 討論

本實驗將保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基對香草醛顯色劑的干擾，采用液液萃取方式提取苷元的同時除去了酒樣中的干擾色素。實驗采用皂苷酸水解顯色法測定保健酒A中的總皂苷含量，以水解后的人參皂苷苷元制備標準曲線。此改良法具有范圍線性良好、準確度高、精確度好、重復性良好等優(yōu)點，因此非常適合用于保健酒中總皂苷含量的定量分析和質(zhì)量控制。

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Determ ination of Total SaponinsContent in Healthcare Liqueur by Acid-HydrolysisM ethod

LEIYan1,ZHANG Xiange1and JING Linzhi2
(1.R&D Departmentof YedaoWine Industry Co.Ltd.,Haikou,Hainan 570105; 2.Suzhou Kosmode BiotechsCo.Ltd.,Suzhou,Jiangsu 215123,China）

To find a bettermethod for the determination of total saponins content in healthcare liqueur,saponinswere separated from the liqueur by SPME,the isolated saponinswere acid-hydrolyzed and then extracted by organic solvent,and aglyconeswere obtained, then aglyconesweremeasured by vanillin-sulfuric acid colorizationmethod and total saponins contentwas obtained eventually w ith ginsenonside Re as the reference standard.The results suggested that Re showed a good linear relationship w ithin the range of 6.8 to 91μg/m l,the linear equation was y=0.011x+0.012(R2=0.999),the average recovery was 99.15±1.9%,and RSD was 1.91%.The precision and the repeatability of thismethod was good.Besides,acid-hydrolysis of saponins could elim inate the interference of sugar on vanillin aswellas the pigments from other ingredients in healthcare liqueur.

healthcare liqueur;totalsaponins;aglycone;vanillin-sulfuric acid colorization

TS262.91；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0096-04

10.13746/j.njkj.2016359

2016-12-02

雷燕(1985-)，女，本科，化工助理工程師，主要從事產(chǎn)品分析、質(zhì)量技術(shù)方面的研發(fā)。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170125.0757.005.htm l。