齊仁立 王琪 吳永江 王敬 黃金秀 楊飛云

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 402460，3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

過表達MicroRNA-199a促進TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡

齊仁立1，2王琪1吳永江3王敬1黃金秀1，2楊飛云1，2

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點實驗室，重慶 402460，3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

旨為探明microRNA-199a（miR-199a）對脂肪細胞凋亡的影響及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）在其中的作用。培養(yǎng)3T3-L1脂肪細胞，使用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）誘導(dǎo)細胞凋亡。在此基礎(chǔ)上分別使用NF-κB阻斷劑PDTC和miR-199a mimic處理細胞，判斷過表達miR-199a對TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡的影響及NF-κB在其中的作用。使用流式細胞儀分析細胞凋亡率，試劑盒檢測Caspase3/7酶活，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測NF-κB活性，qRT-PCR 檢測miR-199a的表達水平，Western blotting檢測NF-κB相關(guān)蛋白變化。結(jié)果顯示，TNFα可以誘導(dǎo)分化的脂肪細胞凋亡并同時激活NF-κB，激活的NF-κB在TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡中發(fā)揮負調(diào)控作用。在脂肪細胞過表達miR-199a明顯抑制NF-κB的激活進而顯著促進TNFα誘導(dǎo)的凋亡。miR-199a通過調(diào)控NF-κB活性參與TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。

MiR-199a；脂肪細胞；凋亡；TNFa；NF-κB

白色脂肪組織被視為哺乳動物的“燃料庫”，脂肪細胞的數(shù)量、尺寸和狀態(tài)對于機體能量平衡具有重要的影響［1］。脂肪的過度積累會導(dǎo)致肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗等多種代謝疾病。此外，脂肪組織還是一種重要的分泌器官，它能分泌產(chǎn)生瘦素、抵抗素和脂聯(lián)素等多種蛋白因子，調(diào)控機體不同的代謝反應(yīng)［2］。當(dāng)生長環(huán)境劇烈改變或者受到刺激時（射線、藥物、細胞因子等）細胞會啟動凋亡—由多基因調(diào)控的細胞程序性死亡［3］。關(guān)于脂肪細胞凋亡的分子機制研究有助于我們更好地了解脂肪的生長和發(fā)育機制，也為肥胖癥等疾病的治療提供新的視角。

腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNFα）能夠誘導(dǎo)包括脂肪細胞在內(nèi)的多種細胞凋亡［4-6］。TNFα作為配體與受體蛋白TNFR結(jié)合，激活死亡受體途徑并傳遞凋亡信號，最終激活Caspase凋亡蛋白級聯(lián)引起細胞凋亡。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，細胞靜息狀態(tài)下NF-κB位于胞漿中沒有活性。在受到藥物、放射線、或者TNFα等蛋白因子的刺激時，NF-κB會被激活并移入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］。激活的NF-κB對細胞凋亡具有重要影響，多數(shù)情況下發(fā)揮負調(diào)控作用，但是某些情況下也會促進凋亡［8，9］。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為18-25 nt的非編碼RNA，在真核生物體內(nèi)廣泛表達［10］。通常情況下，miRNA通過與靶基因3'UTR區(qū)互補結(jié)合，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或抑制其翻譯［11］。一個miRNA通?？梢哉{(diào)控多達數(shù)百個靶基因，進而參與調(diào)控細胞的增殖、分化、激活和凋亡等不同生命事件。

最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對于脂肪細胞增殖和分化具有調(diào)控作用［12］，并且參與了一些癌細胞的凋亡過程［13］。但是miR-199a是否參與了脂肪細胞凋亡的產(chǎn)生和發(fā)展還不清楚。此外，miR-199a與NF-κB通路也有一定作用關(guān)系。脂多糖（LPS）激活癌細胞中的NF-κB并抑制miR-199a的表達，而使用阻斷劑PDTC抑制NF-κB激活則補償性提高miR-199a的表達，說明NF-κB與miR-199a之間存在互作關(guān)系［14］。本實驗試圖探明miR-199a對脂肪細胞凋亡的影響并分析NF-κB在其中扮演的角色，旨在對miRNA功能的研究和脂肪細胞生長發(fā)育調(diào)控的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1前體脂肪細胞購自于中科院上海細胞庫，TNFα購自于Sigma-Aldrich公司（美國），PDTC購自于北京碧云天生物技術(shù)公司，miR-199a mimic由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計合成，TUNEL細胞凋亡檢測試劑購自于Life technology公司（美國），RNA提取試劑和qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購自于TaKaRa公司（日本），NF-κB luciferase reporter plasmid和Casepase3/7活性檢測試劑盒購自于Promega公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 接種并培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細胞，待細胞密度達到70%時開始生脂誘導(dǎo)分化。分化6 d的細胞使用TNFα（終濃度20 ng/mL，）處理6 h然后檢測細胞凋亡率，空白處理作對照。為了檢測NF-κB對凋亡的影響，使用NF-κB通路阻斷劑 PDTC處理細胞1 h，再用TNFα處理6 h，然后檢測NF-κB活性和細胞凋亡率。為了檢測miR-199a對凋亡的影響，使用特異性miR-199a mimic（60 nmol/L）轉(zhuǎn)染細胞，過表達細胞內(nèi)miR-199a。mimic轉(zhuǎn)染24 h后再用TNFa處理，檢測NF-κB活性和細胞凋亡率。

1.2.2 細胞凋亡分析 TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）可以特異性結(jié)合細胞DNA斷裂，是細胞凋亡的重要標(biāo)志。收集5×104個細胞，1%多聚甲醛固定5 min，PBS漂洗，70%乙醇通透細胞4 h，然后使用TUNEL反應(yīng)液孵育細胞1 h，最后使用PI染色20 min并馬上用流式細胞儀（貝克曼公司，美國）檢測凋亡細胞，統(tǒng)計TUNEL陽性細胞（凋亡細胞）占總細胞的比例。

1.2.3 Caspase3/7 活性檢測 Casepase3/7是一種關(guān)鍵的凋亡蛋白，是細胞凋亡通路的終端執(zhí)行因子。細胞中Caspase3/7的酶活性通過試劑盒檢測，具體操作根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行。細胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS溶液漂洗3次，離心收集細胞，加入一定體積的Caspase-Glo?3/7反應(yīng)液室溫條件下孵育2 h，然后使用多功能熒光酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國）檢測光密度。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR MiR-199a的表達水平使用實時熒光定量PCR（qRT- PCR）檢測 使用small RNA試劑提取細胞中的總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀（AB公司，美國）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；（95℃ 5 s 60℃ 35 s）40個循環(huán)。U6為參照基因，2-△△CT法計算基因的相對表達量。

1.2.5 Western blotting收獲細胞并使用RIPA裂解液提取總蛋白 BCA法蛋白檢測試劑盒（康為公司，中國）檢測蛋白濃度。12%的SDS-PAGE膠進行蛋白分離，然后轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF膜（Millipore公司，美國）上。轉(zhuǎn)印完的PVDF膜用5%的脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h。使用相應(yīng)的一抗和二抗溶液孵育PVDF膜。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore公司，美國）和自動發(fā)光曝光儀（Bio-Rad公司，美國）進行拍照分析。試驗用的抗體購自于CST公司（美國），Tublin作為內(nèi)參抗體。

1.2.6 NF-κB活性檢測 使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測NF-κB活性。雙熒光素酶檢測試劑盒和NF-κB luciferase reporter plasmid購自于Promega公司（美國），具體操作步驟參考說明書進行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用SPSS19.0分析軟件包（IBM公司，美國）對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA）或者student's t-test，P ＜ 0.05表示差異顯著，P ＜ 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 抑制NF-κB激活增強TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡

圖1 抑制NF-κB活性促進TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡

圖1 顯示TNFα處理6 h能夠誘導(dǎo)分化的脂肪細胞凋亡，但是誘導(dǎo)作用較為溫和，同時TNFα能夠快速激活細胞內(nèi)的NF-κB。PDTC是一種NF-κB阻斷劑，它顯著抑制了TNFα對 NF-κB的激活作用（圖1-B）。使用PDTC處理細胞1 h后再用TNFα處理細胞，Caspase3/7酶活性顯著提高（圖1-A），凋亡細胞數(shù)顯著增加（圖1-C和1-D）。這說明抑制NF-κB活性能夠促進TNFa誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。

2.2 表達miR-199a增強TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡定量PCR結(jié)果顯示mimic轉(zhuǎn)染使脂肪細胞內(nèi)miR-199a的表達水平增加了42.8倍（圖2-A）。轉(zhuǎn)染mimic 24 h后再用TNFa處理細胞，凋亡細胞數(shù)和caspase3活性均顯著高于只用TNFα處理的細胞（圖2-B，2-C和2-D）。與空白對照組相比，單獨轉(zhuǎn)染mimic對于脂肪細胞凋亡沒有顯著影響。表明過表達miR-199a能夠增強TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。

圖2 過表達miR-199a促進TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡

2.3 過表達miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

我們推測miR-199a調(diào)控TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡可能與NF-κB激活有關(guān)。使用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測NF-κB活性（圖3-A）及Western blotting 檢測NF-κB蛋白水平（圖3-B），結(jié)果表明miR-199a mimic 轉(zhuǎn)染顯著抑制了NF-κB的激活，明顯地減少磷酸化的NF-κB抑制物激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α，IKKα）蛋白和磷酸化的P65蛋白。

3 討論

憑借對眾多靶基因的調(diào)控，microRNA在真核細胞的不同生命活動中扮演了重要的調(diào)控角色。在脂肪細胞上，已經(jīng)有數(shù)十個miRNA的表達和調(diào)控功能被探明，如miR-143和Let-7等［15-18］。并且隨著研究方法和技術(shù)的不斷進步，會有更多涉及脂肪細胞生長和發(fā)育的microRNA被發(fā)現(xiàn)和確認。

miR-199a在哺乳動物的多個組織都有表達，涉及免疫反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、肌肉發(fā)育、癌細胞生長等不同分子事件［19-21］。最近的研究表明，miR-199a對脂肪細胞增殖和分化也由明顯的調(diào)控作用［12］。在豬前體脂肪細胞上過表達miR-199a能夠促進細胞增殖，抑制其向成熟脂肪細胞分化。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對肌細胞生脂也有影響，過表達miR-199a顯著抑制了骨骼肌細胞中脂肪沉積（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。在一些腫瘤細胞上，miR-199a還顯示了細胞凋亡調(diào)控的能力。然而，miR-199a是否參與脂肪細胞凋亡的形成和發(fā)展還不清楚。本實驗結(jié)果確認過表達miR-199a能夠通過抑制NF-κB活性促進TNFa誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。相似的研究發(fā)現(xiàn)激活的NF-κB 能夠抑制miR-199a表達；反之，高水平的miR-199a通過靶向調(diào)控IKKα影響NF-κB的活性［22］。IKKα是NF-κB的上游激酶控制著P65的磷酸化，本實驗同樣發(fā)現(xiàn)過表達miR-199a明顯降低了IKKα的磷酸化水平繼而影響了P65的磷酸化和NF-κB的活性。這些實驗結(jié)果顯示miR-199a和NF-κB之間存在負反饋調(diào)節(jié)機制。

圖3 過表達miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

多數(shù)研究者認為 NF-κB 具有凋亡抑制作用，敲除 RelA 基因會顯著提高胚胎成纖維細胞對于 TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα 能促使RelA-/-小鼠出現(xiàn)肝細胞大量凋亡，并最終導(dǎo)致小鼠死亡［23，24］。但是也有實驗報道了NF-κB的促凋亡作用。例如，Ryan等［25］實驗發(fā)現(xiàn)抑制或者減少 NF-κB 的活性，則會阻斷 P53 引起的凋亡。本實驗確認過表達miR-199a能夠抑制脂肪細胞中NF-κB的活性，增加脂肪細胞對TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα快速激活脂肪細胞中的NF-κB，但是活化的NF-κB反饋抑制了TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。近年來，一些miRNA陸續(xù)被探明涉及NF-κB的活性調(diào)控［26］，這些miRNA也有較大可能性參與細胞凋亡的形成和發(fā)展，但是還需要更多的實驗驗證。

4 結(jié)論

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在TNFa誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡中扮演負調(diào)控角色，而miR-199a可以通過調(diào)控NF-κB的活性促進TNFα誘導(dǎo)的脂肪細胞凋亡。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Over-expression of MicroRNA-199a Intensifies the TNFα-induced Apoptosis of Adipocytes

QI Ren-li1，2WANG Qi1WU Yong-jiang3WANG Jing1HUANG Jin-xiu1，2YANG Fei-yun1，2
（1.Chongqing Academy of Animal Sciences，Chongqing 402460；2.Key Laboratory of Pig Industry Sciences，Ministry of Agriculture，Chongqing 402460；3.Southwest University Rongchang Campus，Chongqing 402460）

The aim of this study is to explore the effects of MicroRNA-199a（miR-199a）on adipocytes apoptosis and the role of nuclear factor κB（NF-κB）. Tumor necrosis factor α（TNFα）was used to induce the apoptosis of cultured 3T3-L1 adipocytes. Based on this work，adding PDTC of NF-κB blocker and miR-199a mimic，the effect of overexpression of miR-199a on TNFα-induced apoptosis and the role of NF-κB in it were determined. The flow cytometry was used to analyze the cell apoptosis，kit Caspase3/7 to detect the enzymatic activities，dual luciferase reporter assay to detect the activity of NF-κB，qRT-PCR to detect the expression of miR-199a，and Western blotting to detect the changes of relevant proteins. As results showed，TNFα induced the apoptosis of differentiated adipocytes，concurrently activated NF-κB. The activated NF-κB played a negative regulator role in the apoptosis of adipocytes mediated by TNFα. Over-expressed miR-199a significantly suppressed the activation of NF-κB，and then remarkably promoted the apoptosis induced by TNFα. Conclusively，miR-199a involves in the TNFα-induced apoptosis of adipocytes through regulating NF-κB activation.

miR-199a；adipocyte；apoptosis；TNFα；NF-κB

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.026

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金項目（31470117，31302055），重慶市畜牧科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費項目（14403）

齊仁立，男，副研究員，研究方向：動物脂肪代謝的基因調(diào)控，E-mail：qirenli1982@163.com；王琪為共同第一作者

楊飛云，男，研究員，E-mail：yfeiyun@yeha.net