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        過表達(dá)MicroRNA-199a促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

        2017-04-06 05:46:32齊仁立王琪吳永江王敬黃金秀楊飛云
        生物技術(shù)通報(bào) 2017年3期
        關(guān)鍵詞:試劑盒調(diào)控脂肪

        齊仁立 王琪 吳永江 王敬 黃金秀 楊飛云

        (1. 重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460;2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 402460,3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū),重慶 402460)

        過表達(dá)MicroRNA-199a促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

        齊仁立1,2王琪1吳永江3王敬1黃金秀1,2楊飛云1,2

        (1. 重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460;2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 402460,3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū),重慶 402460)

        旨為探明microRNA-199a(miR-199a)對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響及核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)在其中的作用。培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞,使用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上分別使用NF-κB阻斷劑PDTC和miR-199a mimic處理細(xì)胞,判斷過表達(dá)miR-199a對(duì)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡的影響及NF-κB在其中的作用。使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率,試劑盒檢測Caspase3/7酶活,雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB活性,qRT-PCR 檢測miR-199a的表達(dá)水平,Western blotting檢測NF-κB相關(guān)蛋白變化。結(jié)果顯示,TNFα可以誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞凋亡并同時(shí)激活NF-κB,激活的NF-κB在TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。在脂肪細(xì)胞過表達(dá)miR-199a明顯抑制NF-κB的激活進(jìn)而顯著促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的凋亡。miR-199a通過調(diào)控NF-κB活性參與TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

        MiR-199a;脂肪細(xì)胞;凋亡;TNFa;NF-κB

        白色脂肪組織被視為哺乳動(dòng)物的“燃料庫”,脂肪細(xì)胞的數(shù)量、尺寸和狀態(tài)對(duì)于機(jī)體能量平衡具有重要的影響[1]。脂肪的過度積累會(huì)導(dǎo)致肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗等多種代謝疾病。此外,脂肪組織還是一種重要的分泌器官,它能分泌產(chǎn)生瘦素、抵抗素和脂聯(lián)素等多種蛋白因子,調(diào)控機(jī)體不同的代謝反應(yīng)[2]。當(dāng)生長環(huán)境劇烈改變或者受到刺激時(shí)(射線、藥物、細(xì)胞因子等)細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡—由多基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡[3]。關(guān)于脂肪細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究有助于我們更好地了解脂肪的生長和發(fā)育機(jī)制,也為肥胖癥等疾病的治療提供新的視角。

        腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNFα)能夠誘導(dǎo)包括脂肪細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡[4-6]。TNFα作為配體與受體蛋白TNFR結(jié)合,激活死亡受體途徑并傳遞凋亡信號(hào),最終激活Caspase凋亡蛋白級(jí)聯(lián)引起細(xì)胞凋亡。核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,細(xì)胞靜息狀態(tài)下NF-κB位于胞漿中沒有活性。在受到藥物、放射線、或者TNFα等蛋白因子的刺激時(shí),NF-κB會(huì)被激活并移入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。激活的NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡具有重要影響,多數(shù)情況下發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,但是某些情況下也會(huì)促進(jìn)凋亡[8,9]。

        MicroRNA(miRNA)是一類長度為18-25 nt的非編碼RNA,在真核生物體內(nèi)廣泛表達(dá)[10]。通常情況下,miRNA通過與靶基因3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合,引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或抑制其翻譯[11]。一個(gè)miRNA通??梢哉{(diào)控多達(dá)數(shù)百個(gè)靶基因,進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、激活和凋亡等不同生命事件。

        最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對(duì)于脂肪細(xì)胞增殖和分化具有調(diào)控作用[12],并且參與了一些癌細(xì)胞的凋亡過程[13]。但是miR-199a是否參與了脂肪細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生和發(fā)展還不清楚。此外,miR-199a與NF-κB通路也有一定作用關(guān)系。脂多糖(LPS)激活癌細(xì)胞中的NF-κB并抑制miR-199a的表達(dá),而使用阻斷劑PDTC抑制NF-κB激活則補(bǔ)償性提高miR-199a的表達(dá),說明NF-κB與miR-199a之間存在互作關(guān)系[14]。本實(shí)驗(yàn)試圖探明miR-199a對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響并分析NF-κB在其中扮演的角色,旨在對(duì)miRNA功能的研究和脂肪細(xì)胞生長發(fā)育調(diào)控的研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        3T3-L1前體脂肪細(xì)胞購自于中科院上海細(xì)胞庫,TNFα購自于Sigma-Aldrich公司(美國),PDTC購自于北京碧云天生物技術(shù)公司,miR-199a mimic由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑購自于Life technology公司(美國),RNA提取試劑和qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購自于TaKaRa公司(日本),NF-κB luciferase reporter plasmid和Casepase3/7活性檢測試劑盒購自于Promega公司(美國)。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 接種并培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)開始生脂誘導(dǎo)分化。分化6 d的細(xì)胞使用TNFα(終濃度20 ng/mL,)處理6 h然后檢測細(xì)胞凋亡率,空白處理作對(duì)照。為了檢測NF-κB對(duì)凋亡的影響,使用NF-κB通路阻斷劑 PDTC處理細(xì)胞1 h,再用TNFα處理6 h,然后檢測NF-κB活性和細(xì)胞凋亡率。為了檢測miR-199a對(duì)凋亡的影響,使用特異性miR-199a mimic(60 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)miR-199a。mimic轉(zhuǎn)染24 h后再用TNFa處理,檢測NF-κB活性和細(xì)胞凋亡率。

        1.2.2 細(xì)胞凋亡分析 TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)可以特異性結(jié)合細(xì)胞DNA斷裂,是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。收集5×104個(gè)細(xì)胞,1%多聚甲醛固定5 min,PBS漂洗,70%乙醇通透細(xì)胞4 h,然后使用TUNEL反應(yīng)液孵育細(xì)胞1 h,最后使用PI染色20 min并馬上用流式細(xì)胞儀(貝克曼公司,美國)檢測凋亡細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)TUNEL陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)占總細(xì)胞的比例。

        1.2.3 Caspase3/7 活性檢測 Casepase3/7是一種關(guān)鍵的凋亡蛋白,是細(xì)胞凋亡通路的終端執(zhí)行因子。細(xì)胞中Caspase3/7的酶活性通過試劑盒檢測,具體操作根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,棄去培養(yǎng)基,PBS溶液漂洗3次,離心收集細(xì)胞,加入一定體積的Caspase-Glo?3/7反應(yīng)液室溫條件下孵育2 h,然后使用多功能熒光酶標(biāo)儀(Biotek公司,美國)檢測光密度。

        1.2.4 RNA提取和qRT-PCR MiR-199a的表達(dá)水平使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT- PCR)檢測 使用small RNA試劑提取細(xì)胞中的總RNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀(AB公司,美國)進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;(95℃ 5 s 60℃ 35 s)40個(gè)循環(huán)。U6為參照基因,2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

        1.2.5 Western blotting收獲細(xì)胞并使用RIPA裂解液提取總蛋白 BCA法蛋白檢測試劑盒(康為公司,中國)檢測蛋白濃度。12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白分離,然后轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF膜(Millipore公司,美國)上。轉(zhuǎn)印完的PVDF膜用5%的脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h。使用相應(yīng)的一抗和二抗溶液孵育PVDF膜。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore公司,美國)和自動(dòng)發(fā)光曝光儀(Bio-Rad公司,美國)進(jìn)行拍照分析。試驗(yàn)用的抗體購自于CST公司(美國),Tublin作為內(nèi)參抗體。

        1.2.6 NF-κB活性檢測 使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB活性。雙熒光素酶檢測試劑盒和NF-κB luciferase reporter plasmid購自于Promega公司(美國),具體操作步驟參考說明書進(jìn)行。

        1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS19.0分析軟件包(IBM公司,美國)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)或者student's t-test,P < 0.05表示差異顯著,P < 0.01表示差異極顯著。

        2 結(jié)果

        2.1 抑制NF-κB激活增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

        圖1 抑制NF-κB活性促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

        圖1 顯示TNFα處理6 h能夠誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞凋亡,但是誘導(dǎo)作用較為溫和,同時(shí)TNFα能夠快速激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB。PDTC是一種NF-κB阻斷劑,它顯著抑制了TNFα對(duì) NF-κB的激活作用(圖1-B)。使用PDTC處理細(xì)胞1 h后再用TNFα處理細(xì)胞,Caspase3/7酶活性顯著提高(圖1-A),凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(圖1-C和1-D)。這說明抑制NF-κB活性能夠促進(jìn)TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

        2.2 表達(dá)miR-199a增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡定量PCR結(jié)果顯示mimic轉(zhuǎn)染使脂肪細(xì)胞內(nèi)miR-199a的表達(dá)水平增加了42.8倍(圖2-A)。轉(zhuǎn)染mimic 24 h后再用TNFa處理細(xì)胞,凋亡細(xì)胞數(shù)和caspase3活性均顯著高于只用TNFα處理的細(xì)胞(圖2-B,2-C和2-D)。與空白對(duì)照組相比,單獨(dú)轉(zhuǎn)染mimic對(duì)于脂肪細(xì)胞凋亡沒有顯著影響。表明過表達(dá)miR-199a能夠增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

        圖2 過表達(dá)miR-199a促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

        2.3 過表達(dá)miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

        我們推測miR-199a調(diào)控TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡可能與NF-κB激活有關(guān)。使用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測NF-κB活性(圖3-A)及Western blotting 檢測NF-κB蛋白水平(圖3-B),結(jié)果表明miR-199a mimic 轉(zhuǎn)染顯著抑制了NF-κB的激活,明顯地減少磷酸化的NF-κB抑制物激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α,IKKα)蛋白和磷酸化的P65蛋白。

        3 討論

        憑借對(duì)眾多靶基因的調(diào)控,microRNA在真核細(xì)胞的不同生命活動(dòng)中扮演了重要的調(diào)控角色。在脂肪細(xì)胞上,已經(jīng)有數(shù)十個(gè)miRNA的表達(dá)和調(diào)控功能被探明,如miR-143和Let-7等[15-18]。并且隨著研究方法和技術(shù)的不斷進(jìn)步,會(huì)有更多涉及脂肪細(xì)胞生長和發(fā)育的microRNA被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。

        miR-199a在哺乳動(dòng)物的多個(gè)組織都有表達(dá),涉及免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉發(fā)育、癌細(xì)胞生長等不同分子事件[19-21]。最近的研究表明,miR-199a對(duì)脂肪細(xì)胞增殖和分化也由明顯的調(diào)控作用[12]。在豬前體脂肪細(xì)胞上過表達(dá)miR-199a能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制其向成熟脂肪細(xì)胞分化。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對(duì)肌細(xì)胞生脂也有影響,過表達(dá)miR-199a顯著抑制了骨骼肌細(xì)胞中脂肪沉積(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在一些腫瘤細(xì)胞上,miR-199a還顯示了細(xì)胞凋亡調(diào)控的能力。然而,miR-199a是否參與脂肪細(xì)胞凋亡的形成和發(fā)展還不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)過表達(dá)miR-199a能夠通過抑制NF-κB活性促進(jìn)TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。相似的研究發(fā)現(xiàn)激活的NF-κB 能夠抑制miR-199a表達(dá);反之,高水平的miR-199a通過靶向調(diào)控IKKα影響NF-κB的活性[22]。IKKα是NF-κB的上游激酶控制著P65的磷酸化,本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-199a明顯降低了IKKα的磷酸化水平繼而影響了P65的磷酸化和NF-κB的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-199a和NF-κB之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

        圖3 過表達(dá)miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

        多數(shù)研究者認(rèn)為 NF-κB 具有凋亡抑制作用,敲除 RelA 基因會(huì)顯著提高胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)于 TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα 能促使RelA-/-小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞大量凋亡,并最終導(dǎo)致小鼠死亡[23,24]。但是也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道了NF-κB的促凋亡作用。例如,Ryan等[25]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制或者減少 NF-κB 的活性,則會(huì)阻斷 P53 引起的凋亡。本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)過表達(dá)miR-199a能夠抑制脂肪細(xì)胞中NF-κB的活性,增加脂肪細(xì)胞對(duì)TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα快速激活脂肪細(xì)胞中的NF-κB,但是活化的NF-κB反饋抑制了TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。近年來,一些miRNA陸續(xù)被探明涉及NF-κB的活性調(diào)控[26],這些miRNA也有較大可能性參與細(xì)胞凋亡的形成和發(fā)展,但是還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

        4 結(jié)論

        核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡中扮演負(fù)調(diào)控角色,而miR-199a可以通過調(diào)控NF-κB的活性促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

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        (責(zé)任編輯 狄艷紅)

        Over-expression of MicroRNA-199a Intensifies the TNFα-induced Apoptosis of Adipocytes

        QI Ren-li1,2WANG Qi1WU Yong-jiang3WANG Jing1HUANG Jin-xiu1,2YANG Fei-yun1,2
        (1.Chongqing Academy of Animal Sciences,Chongqing 402460;2.Key Laboratory of Pig Industry Sciences,Ministry of Agriculture,Chongqing 402460;3.Southwest University Rongchang Campus,Chongqing 402460)

        The aim of this study is to explore the effects of MicroRNA-199a(miR-199a)on adipocytes apoptosis and the role of nuclear factor κB(NF-κB). Tumor necrosis factor α(TNFα)was used to induce the apoptosis of cultured 3T3-L1 adipocytes. Based on this work,adding PDTC of NF-κB blocker and miR-199a mimic,the effect of overexpression of miR-199a on TNFα-induced apoptosis and the role of NF-κB in it were determined. The flow cytometry was used to analyze the cell apoptosis,kit Caspase3/7 to detect the enzymatic activities,dual luciferase reporter assay to detect the activity of NF-κB,qRT-PCR to detect the expression of miR-199a,and Western blotting to detect the changes of relevant proteins. As results showed,TNFα induced the apoptosis of differentiated adipocytes,concurrently activated NF-κB. The activated NF-κB played a negative regulator role in the apoptosis of adipocytes mediated by TNFα. Over-expressed miR-199a significantly suppressed the activation of NF-κB,and then remarkably promoted the apoptosis induced by TNFα. Conclusively,miR-199a involves in the TNFα-induced apoptosis of adipocytes through regulating NF-κB activation.

        miR-199a;adipocyte;apoptosis;TNFα;NF-κB

        10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.026

        2016-06-28

        國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470117,31302055),重慶市畜牧科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(14403)

        齊仁立,男,副研究員,研究方向:動(dòng)物脂肪代謝的基因調(diào)控,E-mail:qirenli1982@163.com;王琪為共同第一作者

        楊飛云,男,研究員,E-mail:yfeiyun@yeha.net

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