齊仁立 王琪 吳永江 王敬 黃金秀 楊飛云

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460，3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

過表達(dá)MicroRNA-199a促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

齊仁立1，2王琪1吳永江3王敬1黃金秀1，2楊飛云1，2

（1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460，3. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

旨為探明microRNA-199a（miR-199a）對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響及核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）在其中的作用。培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，使用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上分別使用NF-κB阻斷劑PDTC和miR-199a mimic處理細(xì)胞，判斷過表達(dá)miR-199a對(duì)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡的影響及NF-κB在其中的作用。使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，試劑盒檢測Caspase3/7酶活，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB活性，qRT-PCR 檢測miR-199a的表達(dá)水平，Western blotting檢測NF-κB相關(guān)蛋白變化。結(jié)果顯示，TNFα可以誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞凋亡并同時(shí)激活NF-κB，激活的NF-κB在TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。在脂肪細(xì)胞過表達(dá)miR-199a明顯抑制NF-κB的激活進(jìn)而顯著促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的凋亡。miR-199a通過調(diào)控NF-κB活性參與TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

MiR-199a；脂肪細(xì)胞；凋亡；TNFa；NF-κB

白色脂肪組織被視為哺乳動(dòng)物的“燃料庫”，脂肪細(xì)胞的數(shù)量、尺寸和狀態(tài)對(duì)于機(jī)體能量平衡具有重要的影響［1］。脂肪的過度積累會(huì)導(dǎo)致肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗等多種代謝疾病。此外，脂肪組織還是一種重要的分泌器官，它能分泌產(chǎn)生瘦素、抵抗素和脂聯(lián)素等多種蛋白因子，調(diào)控機(jī)體不同的代謝反應(yīng)［2］。當(dāng)生長環(huán)境劇烈改變或者受到刺激時(shí)（射線、藥物、細(xì)胞因子等）細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)凋亡—由多基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡［3］。關(guān)于脂肪細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究有助于我們更好地了解脂肪的生長和發(fā)育機(jī)制，也為肥胖癥等疾病的治療提供新的視角。

腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNFα）能夠誘導(dǎo)包括脂肪細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡［4-6］。TNFα作為配體與受體蛋白TNFR結(jié)合，激活死亡受體途徑并傳遞凋亡信號(hào)，最終激活Caspase凋亡蛋白級(jí)聯(lián)引起細(xì)胞凋亡。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞靜息狀態(tài)下NF-κB位于胞漿中沒有活性。在受到藥物、放射線、或者TNFα等蛋白因子的刺激時(shí)，NF-κB會(huì)被激活并移入核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄［7］。激活的NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡具有重要影響，多數(shù)情況下發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，但是某些情況下也會(huì)促進(jìn)凋亡［8，9］。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為18-25 nt的非編碼RNA，在真核生物體內(nèi)廣泛表達(dá)［10］。通常情況下，miRNA通過與靶基因3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，引導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或抑制其翻譯［11］。一個(gè)miRNA通?？梢哉{(diào)控多達(dá)數(shù)百個(gè)靶基因，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、激活和凋亡等不同生命事件。

最近的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對(duì)于脂肪細(xì)胞增殖和分化具有調(diào)控作用［12］，并且參與了一些癌細(xì)胞的凋亡過程［13］。但是miR-199a是否參與了脂肪細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生和發(fā)展還不清楚。此外，miR-199a與NF-κB通路也有一定作用關(guān)系。脂多糖（LPS）激活癌細(xì)胞中的NF-κB并抑制miR-199a的表達(dá)，而使用阻斷劑PDTC抑制NF-κB激活則補(bǔ)償性提高miR-199a的表達(dá)，說明NF-κB與miR-199a之間存在互作關(guān)系［14］。本實(shí)驗(yàn)試圖探明miR-199a對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響并分析NF-κB在其中扮演的角色，旨在對(duì)miRNA功能的研究和脂肪細(xì)胞生長發(fā)育調(diào)控的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1前體脂肪細(xì)胞購自于中科院上海細(xì)胞庫，TNFα購自于Sigma-Aldrich公司（美國），PDTC購自于北京碧云天生物技術(shù)公司，miR-199a mimic由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑購自于Life technology公司（美國），RNA提取試劑和qRT-PCR反應(yīng)試劑盒購自于TaKaRa公司（日本），NF-κB luciferase reporter plasmid和Casepase3/7活性檢測試劑盒購自于Promega公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 接種并培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)開始生脂誘導(dǎo)分化。分化6 d的細(xì)胞使用TNFα（終濃度20 ng/mL，）處理6 h然后檢測細(xì)胞凋亡率，空白處理作對(duì)照。為了檢測NF-κB對(duì)凋亡的影響，使用NF-κB通路阻斷劑 PDTC處理細(xì)胞1 h，再用TNFα處理6 h，然后檢測NF-κB活性和細(xì)胞凋亡率。為了檢測miR-199a對(duì)凋亡的影響，使用特異性miR-199a mimic（60 nmol/L）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)miR-199a。mimic轉(zhuǎn)染24 h后再用TNFa處理，檢測NF-κB活性和細(xì)胞凋亡率。

1.2.2 細(xì)胞凋亡分析 TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）可以特異性結(jié)合細(xì)胞DNA斷裂，是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。收集5×104個(gè)細(xì)胞，1%多聚甲醛固定5 min，PBS漂洗，70%乙醇通透細(xì)胞4 h，然后使用TUNEL反應(yīng)液孵育細(xì)胞1 h，最后使用PI染色20 min并馬上用流式細(xì)胞儀（貝克曼公司，美國）檢測凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)TUNEL陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）占總細(xì)胞的比例。

1.2.3 Caspase3/7 活性檢測 Casepase3/7是一種關(guān)鍵的凋亡蛋白，是細(xì)胞凋亡通路的終端執(zhí)行因子。細(xì)胞中Caspase3/7的酶活性通過試劑盒檢測，具體操作根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS溶液漂洗3次，離心收集細(xì)胞，加入一定體積的Caspase-Glo?3/7反應(yīng)液室溫條件下孵育2 h，然后使用多功能熒光酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國）檢測光密度。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR MiR-199a的表達(dá)水平使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT- PCR）檢測 使用small RNA試劑提取細(xì)胞中的總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀（AB公司，美國）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；（95℃ 5 s 60℃ 35 s）40個(gè)循環(huán)。U6為參照基因，2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting收獲細(xì)胞并使用RIPA裂解液提取總蛋白 BCA法蛋白檢測試劑盒（康為公司，中國）檢測蛋白濃度。12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白分離，然后轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF膜（Millipore公司，美國）上。轉(zhuǎn)印完的PVDF膜用5%的脫脂牛奶溶液室溫封閉2 h。使用相應(yīng)的一抗和二抗溶液孵育PVDF膜。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore公司，美國）和自動(dòng)發(fā)光曝光儀（Bio-Rad公司，美國）進(jìn)行拍照分析。試驗(yàn)用的抗體購自于CST公司（美國），Tublin作為內(nèi)參抗體。

1.2.6 NF-κB活性檢測 使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測NF-κB活性。雙熒光素酶檢測試劑盒和NF-κB luciferase reporter plasmid購自于Promega公司（美國），具體操作步驟參考說明書進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS19.0分析軟件包（IBM公司，美國）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）或者student's t-test，P ＜ 0.05表示差異顯著，P ＜ 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 抑制NF-κB激活增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

圖1 抑制NF-κB活性促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

圖1 顯示TNFα處理6 h能夠誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞凋亡，但是誘導(dǎo)作用較為溫和，同時(shí)TNFα能夠快速激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB。PDTC是一種NF-κB阻斷劑，它顯著抑制了TNFα對(duì) NF-κB的激活作用（圖1-B）。使用PDTC處理細(xì)胞1 h后再用TNFα處理細(xì)胞，Caspase3/7酶活性顯著提高（圖1-A），凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（圖1-C和1-D）。這說明抑制NF-κB活性能夠促進(jìn)TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

2.2 表達(dá)miR-199a增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡定量PCR結(jié)果顯示mimic轉(zhuǎn)染使脂肪細(xì)胞內(nèi)miR-199a的表達(dá)水平增加了42.8倍（圖2-A）。轉(zhuǎn)染mimic 24 h后再用TNFa處理細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)和caspase3活性均顯著高于只用TNFα處理的細(xì)胞（圖2-B，2-C和2-D）。與空白對(duì)照組相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染mimic對(duì)于脂肪細(xì)胞凋亡沒有顯著影響。表明過表達(dá)miR-199a能夠增強(qiáng)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

圖2 過表達(dá)miR-199a促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡

2.3 過表達(dá)miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

我們推測miR-199a調(diào)控TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡可能與NF-κB激活有關(guān)。使用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測NF-κB活性（圖3-A）及Western blotting 檢測NF-κB蛋白水平（圖3-B），結(jié)果表明miR-199a mimic 轉(zhuǎn)染顯著抑制了NF-κB的激活，明顯地減少磷酸化的NF-κB抑制物激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α，IKKα）蛋白和磷酸化的P65蛋白。

3 討論

憑借對(duì)眾多靶基因的調(diào)控，microRNA在真核細(xì)胞的不同生命活動(dòng)中扮演了重要的調(diào)控角色。在脂肪細(xì)胞上，已經(jīng)有數(shù)十個(gè)miRNA的表達(dá)和調(diào)控功能被探明，如miR-143和Let-7等［15-18］。并且隨著研究方法和技術(shù)的不斷進(jìn)步，會(huì)有更多涉及脂肪細(xì)胞生長和發(fā)育的microRNA被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)。

miR-199a在哺乳動(dòng)物的多個(gè)組織都有表達(dá)，涉及免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉發(fā)育、癌細(xì)胞生長等不同分子事件［19-21］。最近的研究表明，miR-199a對(duì)脂肪細(xì)胞增殖和分化也由明顯的調(diào)控作用［12］。在豬前體脂肪細(xì)胞上過表達(dá)miR-199a能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制其向成熟脂肪細(xì)胞分化。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-199a對(duì)肌細(xì)胞生脂也有影響，過表達(dá)miR-199a顯著抑制了骨骼肌細(xì)胞中脂肪沉積（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。在一些腫瘤細(xì)胞上，miR-199a還顯示了細(xì)胞凋亡調(diào)控的能力。然而，miR-199a是否參與脂肪細(xì)胞凋亡的形成和發(fā)展還不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)過表達(dá)miR-199a能夠通過抑制NF-κB活性促進(jìn)TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。相似的研究發(fā)現(xiàn)激活的NF-κB 能夠抑制miR-199a表達(dá)；反之，高水平的miR-199a通過靶向調(diào)控IKKα影響NF-κB的活性［22］。IKKα是NF-κB的上游激酶控制著P65的磷酸化，本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-199a明顯降低了IKKα的磷酸化水平繼而影響了P65的磷酸化和NF-κB的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-199a和NF-κB之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖3 過表達(dá)miR-199a抑制TNFα激活NF-κB

多數(shù)研究者認(rèn)為 NF-κB 具有凋亡抑制作用，敲除 RelA 基因會(huì)顯著提高胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)于 TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα 能促使RelA-/-小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞大量凋亡，并最終導(dǎo)致小鼠死亡［23，24］。但是也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道了NF-κB的促凋亡作用。例如，Ryan等［25］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制或者減少 NF-κB 的活性，則會(huì)阻斷 P53 引起的凋亡。本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)過表達(dá)miR-199a能夠抑制脂肪細(xì)胞中NF-κB的活性，增加脂肪細(xì)胞對(duì)TNFα介導(dǎo)的凋亡的敏感度。TNFα快速激活脂肪細(xì)胞中的NF-κB，但是活化的NF-κB反饋抑制了TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。近年來，一些miRNA陸續(xù)被探明涉及NF-κB的活性調(diào)控［26］，這些miRNA也有較大可能性參與細(xì)胞凋亡的形成和發(fā)展，但是還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在TNFa誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡中扮演負(fù)調(diào)控角色，而miR-199a可以通過調(diào)控NF-κB的活性促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Over-expression of MicroRNA-199a Intensifies the TNFα-induced Apoptosis of Adipocytes

QI Ren-li1，2WANG Qi1WU Yong-jiang3WANG Jing1HUANG Jin-xiu1，2YANG Fei-yun1，2
（1.Chongqing Academy of Animal Sciences，Chongqing 402460；2.Key Laboratory of Pig Industry Sciences，Ministry of Agriculture，Chongqing 402460；3.Southwest University Rongchang Campus，Chongqing 402460）

The aim of this study is to explore the effects of MicroRNA-199a（miR-199a）on adipocytes apoptosis and the role of nuclear factor κB（NF-κB）. Tumor necrosis factor α（TNFα）was used to induce the apoptosis of cultured 3T3-L1 adipocytes. Based on this work，adding PDTC of NF-κB blocker and miR-199a mimic，the effect of overexpression of miR-199a on TNFα-induced apoptosis and the role of NF-κB in it were determined. The flow cytometry was used to analyze the cell apoptosis，kit Caspase3/7 to detect the enzymatic activities，dual luciferase reporter assay to detect the activity of NF-κB，qRT-PCR to detect the expression of miR-199a，and Western blotting to detect the changes of relevant proteins. As results showed，TNFα induced the apoptosis of differentiated adipocytes，concurrently activated NF-κB. The activated NF-κB played a negative regulator role in the apoptosis of adipocytes mediated by TNFα. Over-expressed miR-199a significantly suppressed the activation of NF-κB，and then remarkably promoted the apoptosis induced by TNFα. Conclusively，miR-199a involves in the TNFα-induced apoptosis of adipocytes through regulating NF-κB activation.

miR-199a；adipocyte；apoptosis；TNFα；NF-κB

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.026

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470117，31302055），重慶市畜牧科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（14403）

齊仁立，男，副研究員，研究方向：動(dòng)物脂肪代謝的基因調(diào)控，E-mail：qirenli1982@163.com；王琪為共同第一作者

楊飛云，男，研究員，E-mail：yfeiyun@yeha.net