姚海飛張萬紅嚴(yán)曙光

（1.淮安市洪澤區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇洪澤 223100；

2.淮安市洪澤區(qū)東雙溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇洪澤 223100）

豬偽狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)及應(yīng)用進(jìn)展

姚海飛1張萬紅1嚴(yán)曙光2

（1.淮安市洪澤區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇洪澤 223100；

2.淮安市洪澤區(qū)東雙溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇洪澤 223100）

豬偽狂犬?。≒seudorabies）是一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、繁殖障礙為主要癥狀的急性、熱性傳染病。病原為偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）。近年來該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病尚無特效治療藥物，主要采用疫苗接種作為重點(diǎn)防控手段。因此，本文重點(diǎn)綜述了近年來臨床使用較廣泛的豬偽狂犬基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)及應(yīng)用情況。

豬偽狂犬??；弱毒疫苗；基因缺失

豬偽狂犬病是由皰疹病毒科偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、繁殖障礙為主要癥狀的急性、熱性傳染病[1]。我國(guó)將本病列為二類動(dòng)物疫病。豬是偽狂犬病毒的天然宿主、貯存者和傳播者。該病毒可感染各個(gè)年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、哺乳仔豬高死亡率及種豬不育等，而且該病還可影響免疫系統(tǒng)，繼而導(dǎo)致與其他疾病（如藍(lán)耳病等）發(fā)生混合感染的概率大大提高[2]。目前，豬偽狂犬病在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著豬群的健康，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

該病最為有效的策略防控是疫苗免疫。目前我國(guó)使用最廣泛的是通過基因工程改造的PRV活病毒疫苗，本文將對(duì)該類疫苗目前的研究進(jìn)展進(jìn)行論述。

1 PRV基因缺失疫苗研究進(jìn)展

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，以及對(duì)PRV各病毒蛋白功能的不斷深入研究，一類新型的PRV減毒活疫苗逐漸發(fā)展起來。該類疫苗主要通過分子生物學(xué)的手段，對(duì)PRV基因組中毒力基因若干堿基進(jìn)行刪除，已達(dá)到徹底失活該基因的目的，但仍能保留該毒株較強(qiáng)的免疫原性。

1.1 單基因缺失PRV疫苗

1.1.1 TK單基因缺失的PRV疫苗

該類疫苗是1986年美國(guó)批準(zhǔn)上市的的第一批PRV基因工程疫苗。該疫苗以BUK毒株為母本，缺失TK序列上一段148bp長(zhǎng)度的序列構(gòu)建而成。該毒株非常穩(wěn)定，在傳代多次后仍保持TK缺失狀態(tài)。該類疫苗代表性毒株包括BUK-dl3、NIA-3、ADV-783、Begonia等毒株。動(dòng)物試驗(yàn)表明，該疫苗不僅安全性好，而且攻毒保護(hù)率較高[3]。我國(guó)學(xué)者也分別在本土PRV流行毒株的基礎(chǔ)上成功缺失了TK基因并對(duì)缺失毒株進(jìn)行了一系列生物學(xué)特性等研究并取得較好進(jìn)展[4-6]。總體而言，TK單缺失后PRV毒力可以下降到尚可接受的水平，故當(dāng)前的PRV基因工程疫苗均在現(xiàn)有TK基因單缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)。

1.1.2 gD單基因缺失PRV疫苗

gD基因有利于增強(qiáng)子代病毒感染性，進(jìn)而增強(qiáng)感染動(dòng)物向其他動(dòng)物傳播的能力。因此缺失該基因制備的PRV基因工程疫苗對(duì)動(dòng)物的毒力較低，且可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生了較好保護(hù)力。

1.2 雙基因缺失PRV疫苗

盡管TK基因缺失可以顯著降低毒株毒力，但無法用血清學(xué)的方法區(qū)分野毒感染和疫苗感染，因此在TK缺失的基礎(chǔ)上，在編碼非必需糖蛋白的基因內(nèi)引入一個(gè)新的缺失，或插入一個(gè)報(bào)告基因，這樣得到的突變株不能產(chǎn)生缺失糖蛋白，免疫動(dòng)物后不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，因此可以通過血清學(xué)方法區(qū)分免疫接種和野毒感染豬，多基因的缺失也有助于進(jìn)一步降低毒株的毒力。

1.2.1 TK-/gE-雙缺失疫苗

gE基因缺失有助于對(duì)疫苗接種和野毒感染豬只做鑒別診斷，因此在TK缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步缺失gE基因研制PRV基因工程疫苗，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。VanOirschot等于1990年以NIA-4為母本病毒，成功構(gòu)建了TK/gE雙基因缺失株，該疫苗免疫動(dòng)物后對(duì)豬、牛、羊均安全性較好[7]。我國(guó)彭大新等通過Cre/loxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了基于PRV-JSZ株的TK/gE雙基因缺失株，并表現(xiàn)較好的安全性和保護(hù)力[8]。

1.2.2 TK-/gG-雙缺失疫苗

該疫苗主要以TK-單缺失毒株為母本，進(jìn)一步構(gòu)建TK-/gG-雙缺失毒株，該毒株對(duì)豬無致病性，但對(duì)牛、犬、貓毒性較強(qiáng)。該疫苗免疫豬后，對(duì)強(qiáng)毒株具有較好抵抗力。而且通過建立基于gG蛋白的ELISA方法可以區(qū)分野毒感染與疫苗接種。但該檢測(cè)方法的靈敏度仍然不及基于gE蛋白的ELISA方法，因此一定程度限制了TK-/gG-疫苗的推廣。不過我國(guó)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春院士基于HB-98株所改進(jìn)研制TK-/gG-雙缺失疫苗目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)反饋較好。

1.2.3 TK-/gC-雙缺失疫苗

gC基因也可以作為該類疫苗區(qū)分野毒和疫苗毒的標(biāo)記，有學(xué)者[9]以BUK-dl3株為親本，進(jìn)一步缺失了gC基因片段，構(gòu)建了TK-/ gC-雙缺失毒株，通過建立可建立基于gC蛋白的ELISA檢測(cè)方法，可以達(dá)到鑒別野毒感染和疫苗接種的目的。但該疫苗免疫效果還有待進(jìn)一步提高。

1.3 三基因缺失PRV疫苗

TK-/gE-/gI-三基因缺失苗：

我國(guó)學(xué)者郭萬柱等[10]于2003年首次以TK-單缺失株的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了TK-/gE-/gI-三基因缺失株，而且該母本毒株是我國(guó)主要的流行毒株，疫苗通過進(jìn)一步的安全性評(píng)估、免疫保護(hù)試驗(yàn)及進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)證實(shí)該疫苗是一種安全性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、免疫效果好的疫苗，并已獲新獸藥證書。

1.4 四基因缺失PRV疫苗

選擇更多基因的缺失，是大幅度降低PRV毒株的毒力的策略，而且可以有效降低疫苗的排毒率。

1.4.1 gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

四基因缺失策略早在1990年國(guó)外學(xué)者已開展相關(guān)研究[11]，所構(gòu)建的gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，能有效提高對(duì)仔豬的免疫保護(hù)水平，而且并未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

1.4.2 gD-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

Mettenleiter等[12]在原有四缺苗的基礎(chǔ)上，將gC-置換為gD-，并基于已改造的gD-穩(wěn)定細(xì)胞系，成功構(gòu)建了gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，進(jìn)一步試驗(yàn)表明，該毒株的安全性顯著提高，而且可以顯著降低豬只的排毒水平。

2 小結(jié)與展望

動(dòng)物疫苗研發(fā)從傳統(tǒng)疫苗向基因工程疫苗發(fā)展將是未來整個(gè)行業(yè)的趨勢(shì)，而且特別作為弱毒疫苗來說，標(biāo)記疫苗更是解決如何區(qū)分野毒感染和疫苗接種的重要手段。而我國(guó)豬偽狂犬基因工程標(biāo)記疫苗正是目前應(yīng)用最為成功的動(dòng)物標(biāo)記疫苗。對(duì)推動(dòng)其他疫病基因工程標(biāo)記疫苗的研發(fā)和推廣具有重大的指導(dǎo)意義。但該類疫苗仍然面臨毒力返強(qiáng)、排毒抑制不徹底等問題，但隨著我國(guó)動(dòng)物疫苗研制水平的不斷提升，同時(shí)完善豬偽狂犬病的綜合防控體系，最終將實(shí)現(xiàn)我國(guó)根除該病的目標(biāo)。

[1] An，T.Q.，Peng，J.M.，Tian，Z.J.，Zhao，H.Y.，Li，N.，Liu，Y.M.，Chen，J.Z.，Leng，C.L.，Sun，Y.，Chang，D.，Tong，G.Z.，2013.Pseudorabies virus variant in bartha-K61-vaccinated pigs，China[J].Emerg.Infect.Dis.，2012（19）：1749-1755.

[2] Wang，H.G.，Yang，D.Y.，Luo，X.F.，Zeng，Z.Y.，Li，C.Y.，Gan，Z.L.，Wang，F(xiàn).，Liu，J.，Hao，F(xiàn).，Research progress of mixed infections of classical swine fever and other diseases[J].Chin. Swine Indus，2013，（4）：56-58.

[3] Mettenleiter，T.C.，Lukacs，N.，Rziha，H.J.，Mapping of the structural gene of pseudorabies virus glycoprotein A and identification of two non-glycosylated precursor polypeptides[J].J.Virol.1985，（53）：52-57.

[4] 周復(fù)春，陳煥春，方六榮，等.偽狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，（5）：417-420.

[5] 蘇鑫銘.偽狂犬病病毒上海株 TK 基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性初步研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[6] 陳瑞愛，邵定勇，韓靜芳.豬偽狂犬病毒TK缺失株P(guān)RV/TK_&構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（5）：577-582.

[7] Van Oirschot J T，Terpstra C，Moormann R J M，et al.Safety of an Aujeszky's disease vaccine based on deletion mutant strain 783 which does not express thymidine kinase and glycoprotein I[J].Vet Rec，1990，127（10）：443-446.

[8] 梁苑燕，胡艷芬，張小榮，等.應(yīng)用Cre-loxP 系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病病毒gE/TK雙缺失株[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（11）：1802-1809.

[9] Kit S，Pirtle E C.Attenuated properties of thymidine kinase negative deletion mutant of pseudorabies virus[J].Am J Yet Res，1985，46 （6）：1359-1367.

[10] 郭萬柱，徐志文，王小玉，等.新型偽狂犬病病毒基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究（初報(bào)）[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，18（1）：1-3.

[11] Mettenleiter TC，Kem H，Rauh L Isolation of a viable herpesvirus （pseudorabies virus）mutant specifically lacking all four known nonessential glycoproteins[J].Virology，1990，179（1）：498-503.

[12] Mettenleiter TC，Klupp BG，Weiland F，et al.Characterization of a quadruple glycoprotein deleted pseudorabies virus mutant for use as a biologically safe live virus vaccine[J].J Gen Virol，1994，75（7）：1723-1733.

2016年度江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目“生豬偽狂犬病綜合凈化技術(shù)”（項(xiàng)目編號(hào)：SXGC[2016]160）

姚海飛（1987—），男，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)本科畢業(yè)，農(nóng)學(xué)學(xué)士，初級(jí)獸醫(yī)師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，淮安市洪澤區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。