周世崇,常 才,樂(lè) 堅(jiān),范亦武,陳 敏
復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院超聲診斷科,復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系,上海 200032
目前,國(guó)內(nèi)女性惡性腫瘤中乳腺癌發(fā)病率居第1位[1]。新輔助化療在其治療中應(yīng)用日益廣泛[2],但療效評(píng)估仍依賴(lài)最終病理分級(jí)?,F(xiàn)有影像學(xué)技術(shù)可監(jiān)測(cè)腫瘤在化療前后的大小變化,但無(wú)法在化療早期預(yù)測(cè)最終療效[3-4]?,F(xiàn)有研究顯示,腫瘤可促進(jìn)大量新生血管產(chǎn)生,這是其生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[5]。超聲造影劑具有純血池灌注特性,本研究擬通過(guò)超聲造影觀察化療前后腫瘤血供改變,以達(dá)到早期預(yù)測(cè)化療療效的目的。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)BALB/c裸鼠,雌性,4周齡。人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,制成密度約為2×107/mL的細(xì)胞懸液。于每只裸鼠右側(cè)胸壁乳墊下注射接種0.3 mL細(xì)胞懸液,誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生乳腺癌。接種后連續(xù)觀察1周,以接種部位皮下出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)、質(zhì)地較硬等指標(biāo)認(rèn)為成瘤。4周后,瘤體長(zhǎng)至直徑約2.0 cm時(shí)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
將荷瘤裸鼠按完全隨機(jī)法分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組30只。每組再按給藥時(shí)間點(diǎn)分成3個(gè)亞組,每個(gè)亞組10只?;熐敖M:不給藥,第1天給藥前處死?;?次組:第1天給藥,第7天第2次給藥前處死?;?次組:第1、7天貫序給藥,第14天處死。各亞組小鼠于處死前稱(chēng)量體質(zhì)量,測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑及短徑,腫瘤體積換算公式=長(zhǎng)徑×短徑2/2。
實(shí)驗(yàn)組給藥方案C M F:環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,C)+甲氨蝶呤(methotrexate,M)+氟尿嘧啶(fluorouracil,F(xiàn))。給藥劑量嚴(yán)格依據(jù)Lloyd等的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[6],單藥劑量為2/3 LD10。各藥LD10劑量具體如下[7-9]:環(huán)磷酰胺100 mg/kg,甲氨蝶呤27 mg/kg,氟尿嘧啶140 mg/kg。模擬臨床給藥方案CMF。在實(shí)驗(yàn)組亞組給藥的同時(shí),相應(yīng)對(duì)照組亞組給予生理鹽水,均為腹腔注射。
全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于處死前進(jìn)行超聲造影檢查。使用意大利Esaote公司MyLab90多普勒彩色超聲診斷儀,探頭頻率8~12 MHz。超聲造影劑為意大利Bracco公司SonoVue,每只裸鼠通過(guò)尾靜脈注射0.005 mL。注射后立即進(jìn)行造影觀察,記錄數(shù)據(jù)。造影結(jié)束后于探頭下置入定位針,確定觀察區(qū)域。采用德國(guó)TomTec公司分析軟件SonoLiver脫機(jī)分析造影數(shù)據(jù),獲取以下造影參數(shù):腫瘤灌注峰值強(qiáng)度(maximum intensity,IMAX),即造影劑灌注達(dá)峰時(shí)對(duì)比對(duì)照區(qū)域的強(qiáng)度值;上升時(shí)間(rising time,RT),即灌注從峰值10%至90%強(qiáng)度所需時(shí)間;灌注達(dá)峰時(shí)間(time to peak,TTP),即從開(kāi)始灌注至達(dá)峰所需時(shí)間;平均渡越時(shí)間(mean transit time,mTT),即病灶峰值強(qiáng)度下降一半所需時(shí)間。
全部裸鼠于置入定位針后脫頸處死,沿探頭方向剖開(kāi)瘤體,取定位針?biāo)诤穸燃s5 mm、長(zhǎng)度包含全部造影瘤體的組織,固定后石蠟包埋切片。檢測(cè)微血管密度(microvascular density,MVD),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-1/2/3。將實(shí)驗(yàn)組中化療前亞組和2次化療亞組的腫瘤標(biāo)本切片,于光學(xué)高倍鏡下進(jìn)行腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)。
腫瘤生物指標(biāo)包括荷瘤裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積(表1)。第1次給藥后:體質(zhì)量組間對(duì)照(P=0.000)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.000)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;腫瘤體積組間對(duì)照(P=0.000)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組內(nèi)對(duì)照(P=0.539)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2次給藥后:體質(zhì)量組間對(duì)照(P=0.000)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.000)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;腫瘤體積組間對(duì)照(P=0.000)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組內(nèi)對(duì)照(P=0.46)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
微循環(huán)指標(biāo)包括MVD、VEGFR-1/2/3(表2)。第1次給藥后:MVD組間對(duì)照(P=0.138)和VEGFR-3組間對(duì)照(P=0.069)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組內(nèi)對(duì)照(P=0.205)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;VEGFR-1組間對(duì)照(P=0.008)顯著下降,VEGFR-1組內(nèi)對(duì)照(P=0.007)顯著下降。第2次給藥后:MVD組間對(duì)照(P=0.000)和VEGFR-3組間對(duì)照(P=0.003)顯著下降,MVD組內(nèi)對(duì)照(P=0.004)顯著下降;VEGFR-1組間對(duì)照(P=0.000)顯著下降,VEGFR-1組內(nèi)對(duì)照(P=0.000)顯著下降。鏡下切片見(jiàn)圖1~2。
超聲造影指標(biāo)包括IMAX、RT、TTP和mTT(表3)。第1次給藥后:IMAX組間對(duì)照(P=0.001)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.000)顯著下降;TTP組間對(duì)照(P=0.427)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.376)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第2次給藥后:IMAX組間對(duì)照(P=0.000)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.000)顯著下降;TTP組間對(duì)照(P=0.001)和組內(nèi)對(duì)照(P=0.001)顯著上升。超聲造影見(jiàn)圖3~5。
表 1 腫瘤生物指標(biāo)
在光學(xué)顯微鏡40倍物鏡下計(jì)數(shù),化療前實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞密度為464.92±60.85/HF,2次化療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞密度為136.99±17.3/HF,化療后腫瘤細(xì)胞顯著減少(P=0.000)。
表 2 腫瘤微循環(huán)指標(biāo)
表 3 超聲造影參數(shù)
圖 1 實(shí)驗(yàn)組化療前、化療1次、化療2次的MVD鏡下切片
圖 2 實(shí)驗(yàn)組化療前、化療1次、化療2次的VEGFR-1鏡下切片
圖 3 化療前腫瘤超聲造影圖
圖 4 化療1次后的腫瘤超聲造影圖
圖 5 化療2次后的腫瘤超聲造影圖像
目前,超聲造影預(yù)測(cè)抗血管生成藥物療效的研究比較多。有研究報(bào)道[10-14],在動(dòng)物腫瘤模型中使用抗血管生成藥物,伴隨著腫瘤微循環(huán)指標(biāo)降低,超聲造影參數(shù)出現(xiàn)不同程度的改變,部分研究認(rèn)為超聲造影參數(shù)與抗血管療效相關(guān)。然而,臨床使用的大部分化療藥物主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA和RNA合成來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng),作用機(jī)制不同于抗血管藥物。有研究報(bào)道[15-16],超聲造影在新輔助化療前后曲線有顯著變化,但缺乏足夠的量化參數(shù)。有研究報(bào)道[17-19],單獨(dú)使用化療藥物如順鉑或阿霉素,可觀察到腫瘤的微循環(huán)指標(biāo)改變,且伴有超聲造影參數(shù)變化,但他們沒(méi)有研究早期變化與腫瘤化療療效的關(guān)系。本研究模擬臨床聯(lián)合化療方案,探討用藥后腫瘤微循環(huán)指標(biāo)的改變及超聲造影指標(biāo)的改變,并分析兩者的關(guān)系。
本研究中,MVD在第2次化療后的組內(nèi)和組間出現(xiàn)顯著下降,與既往報(bào)道[17-19]吻合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),VEGFR-1在首次化療后組內(nèi)和組間即出現(xiàn)顯著下降,提示作為微循環(huán)指標(biāo),其可能比MVD對(duì)化療藥物更敏感。2次化療后,腫瘤細(xì)胞下降70%以上,按病理MP分級(jí),屬不完全緩解中的3級(jí)。浸潤(rùn)癌細(xì)胞的降低達(dá)30%~90%,屬中度減少。由此可見(jiàn),腫瘤細(xì)胞被化療滅活的同時(shí),出現(xiàn)了顯著微循環(huán)改變。
第2次化療后TTP在組間和組內(nèi)均顯著上升,提示腫瘤滅活后灌注時(shí)間延長(zhǎng),很可能是微循環(huán)受到破壞所致。對(duì)比病理結(jié)果,腫瘤體積在2次化療后較化療前未出現(xiàn)顯著變化,而部分微循環(huán)指標(biāo)和部分造影指標(biāo)出現(xiàn)顯著變化,兩者具有一致性,均早于腫瘤物理體積的變化。
在乳腺癌新輔助化療模型中,超聲造影部分指標(biāo)變化與腫瘤微循環(huán)指標(biāo)變化具有一致性,均早于腫瘤物理體積變化。雖然尚未證實(shí)兩者相關(guān),但值得進(jìn)一步深入研究。
本研究存在以下不足:樣本量相對(duì)較小,無(wú)法進(jìn)行相關(guān)性分析;僅模擬了一種新輔助化療方案;MCF-7細(xì)胞也不能體現(xiàn)乳腺癌免疫組化和基因分型的多樣性。
綜上所述,超聲造影參數(shù)IMAX和TTP在化療過(guò)程中,與腫瘤微循環(huán)指標(biāo)MVD和VEGFR-1的變化具有一致性,提示超聲造影具備了預(yù)測(cè)新輔助化療療效的潛力。
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