石慶新　呂小萍　於青峰　楊陽

[摘要] 目的 探討鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CPA）體外抗菌活性的影響。方法 實驗采用肉湯稀釋法測定鹽酸小檗堿和亞胺培南耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌最小抑菌濃度（MIC）；采用棋盤稀釋法測定鹽酸小檗堿聯(lián)合亞胺培南對CPA的MIC，并計算聯(lián)合指數(shù)（FIC）。 結(jié)果 鹽酸小檗堿和亞胺培南對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC的算術(shù)均數(shù)分為268.80 μg/mL和8.93 μg/mL。用亞胺培南與鹽酸小檗堿聯(lián)合作用后，鹽酸小檗堿與亞胺培南MIC的算術(shù)均數(shù)分別降至8.16 μg/mL和4.50 μg/mL。兩種藥物聯(lián)合使用對6.7%的60株CPA有協(xié)同的抗菌作用，對88.3%CPA呈現(xiàn)相加作用，對5.0%CPA呈現(xiàn)無關(guān)作用，無拮抗作用。 結(jié)論 鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用可以增加兩者對CPA抗菌作用的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸小檗堿；銅綠假單胞菌；協(xié)同作用；碳青霉烯酶；亞胺培南

[中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）01-0114-04

銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，也是醫(yī)院院內(nèi)感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、敗血癥、傷口感染、尿路感染等，近年來其分離率和耐藥率都不斷的呈上升趨勢[2]。根據(jù)2013年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對碳青霉稀類的耐藥率達(dá)到25%以上，且出現(xiàn)了廣泛耐藥菌株[3]。銅綠假單胞菌對抗菌藥物耐藥形勢非常嚴(yán)峻，給臨床治療帶來了難題。

鹽酸小渠堿是中藥黃連提取物，也是一種生物堿，《中國藥典》記載黃連和鹽酸小檗堿具有抗菌消炎等藥理作用[4]。有關(guān)鹽酸小檗堿對銅綠假單胞菌的抗菌作用研究很少。本實驗擬通過鹽酸小檗堿和亞胺培南的體外聯(lián)合藥敏試驗研究，評價兩種藥物的聯(lián)合用藥的抗菌效果。為臨床治療耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌“超級細(xì)菌” 提供實驗依據(jù)和新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期間，從臺州恩澤醫(yī)院和臺州路橋醫(yī)院住院患者中各分離40株和60株CPA（剔除重復(fù)分離菌株）。100株臨床菌株通過法國梅里埃VITEK2-CompactT檢測，然后通過Hodge實驗[5]確認(rèn)篩選出耐碳?xì)涿赶╊愩~綠假單胞菌60株。質(zhì)控菌株27853購于中國衛(wèi)生部臨檢中心。

1.1.2 抗菌藥物 鹽酸小檗堿分析標(biāo)準(zhǔn)品批號為160528，純度98%，規(guī)格1 g/支；亞胺培南批號為160421，純度98%，規(guī)格5 g/支，購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 實驗前將所有保存菌種經(jīng)復(fù)融、轉(zhuǎn)種、分離培養(yǎng)，在同一平板上取性狀相似1～2個菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)10～12 h。再用 RPMI1640液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌LB培養(yǎng)液使其密度為2～6×108 CFU/L 菌懸液備用。實驗時再將備用菌懸液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到100倍，最終密度為2～6×106 CFU/L接種菌懸液。

1.2.2 藥物濃度的配制 先用無菌蒸餾水把鹽酸小檗堿和亞胺培南干粉堿分別配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素藥敏微量稀釋原理：鹽酸小檗堿起始濃度為2048 μg/ml，第1孔的濃度為2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀釋對藥物進(jìn)行倍比稀釋，稀釋到第10管孔濃度為2 μg/mL，得到的鹽酸小檗堿的濃度范圍在2～1024 μg/mL之間。亞胺培南起始濃度為256 μg/mL，用同樣的方法稀釋最終得到亞胺培南的濃度范圍在0.125～128 μg/mL之間。

1.2.3 鹽酸小檗堿和亞胺培南單獨(dú)藥敏試驗 根據(jù)NCCLS微量倍比稀釋原理在96孔的V型檢測板加入藥敏原液并稀釋至第10孔為最低檢測濃度的2倍，然后再第1孔至第11孔加入50 μL稀釋好的菌懸液，使最終每孔菌液濃度為l×105 CFU/mL，第11孔為不加細(xì)菌的對照孔，第12孔為空白對照孔。然后混勻加蓋置37℃孵育箱，18～24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 鹽酸小檗堿交叉聯(lián)合抗真菌藥物藥敏試驗 采用棋盤微量稀釋法檢測藥物的聯(lián)合作用，采用9個稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的4倍，依次倍比稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍濃度，兩種藥物稀釋分別在96孔培養(yǎng)板上按橫和縱兩列進(jìn)行聯(lián)合[7]。接種菌量為1×105 CFU/mL，銅綠假單胞菌分別于37℃孵育18～24 h后觀察細(xì)菌生長情況。用部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）作為評價聯(lián)合藥敏試驗效果。

1.2.5 FIC的計算及判定標(biāo)準(zhǔn)[6] FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用結(jié)果判斷：①FIC指數(shù)≤0.5判定甲乙兩藥為協(xié)同作用；②0.52判定甲乙兩藥為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 單藥作用

鹽酸小檗堿對銅綠假單胞菌MIC范圍為256～512 μg/mL，MIC幾何均值為265.02 μg/mL；亞胺培南對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC范圍為8～32 μg/mL MIC幾何均值為8.57 μg/mL。

2.2 聯(lián)合用藥

兩種藥物聯(lián)合使用時，鹽酸小檗堿對銅綠假單胞菌MIC減至為2～32 μg/mL；亞胺培南對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC減至為2～16 μg/mL見表1。兩種藥物對6.7%的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌有協(xié)同的抗菌作用，88.3%耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)相加作用，對5.0%耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)無關(guān)作用，無拮抗作用，見表1。

2.3 亞胺培南與鹽酸小檗堿單獨(dú)使用和聯(lián)合使用情況下MIC比較

亞胺培南單獨(dú)使用和其與鹽酸小檗堿聯(lián)合使用時MIC值的比較采用t檢驗，兩者存在顯著性差異（t=15.11，P=0.00<0.01）。同樣鹽酸小檗堿單獨(dú)使用和其與亞胺培南聯(lián)合使用時的MIC值比較，存在顯著性差異（t=36.18，P=0.00<0.01）。見表2。

3 討論

銅綠假單胞菌是革蘭陰性非發(fā)酵菌，存在正常人的皮膚、腸道和呼吸道等部位。隨著抗生素不合理使用及廣泛使用，銅綠假單胞菌對抗菌藥物耐藥率也不斷上升，對多種耐藥甚至幾乎全部抗生素耐藥，這給治療銅綠假單胞菌所致感染帶來了巨大的挑戰(zhàn)，使其成為所謂的“超級細(xì)菌”[8]。本課題從中西藥聯(lián)合使用的角度探索治療耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌方法。

從結(jié)果來看，用微量稀釋法檢測耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌對亞胺培南的MIC均值為8.93 μg/mL，此結(jié)果與儀器法檢測的MIC范圍是一致，其判斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）藥敏試驗的標(biāo)準(zhǔn)[9]。中藥提取物鹽酸小檗堿對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌也具有抗菌作用，單獨(dú)使用時其MIC的濃度為268.80 μg/mL。這個濃度比Sun Y等[10]的實驗結(jié)果偏高?？赡苁且驗槲覀儗嶒灲M選擇的菌株耐藥性與他們實驗組不同；他們實驗的菌株是普通銅綠假單胞菌，而我們組選擇的菌株全都是耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌。目前本文認(rèn)為銅綠假單胞菌耐碳?xì)涿赶╊悪C(jī)制有以下幾點：（1）產(chǎn)金屬酶，其可以水解碳?xì)涿赶╊惡退笑?內(nèi)酰胺類抗生素，并且不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[11]，通過染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因，主要在銅綠假單胞菌和其他非發(fā)酵菌之間傳播。其基因分型分為GIM型1、VIM、 SPM、IMP等，在我國臨床分離的耐藥菌株以VIM、IMP基因型為主[12，13]。（2）藥物作用靶位的改變：β-內(nèi)胺類抗菌藥物與細(xì)菌細(xì)胞膜上特定靶位相結(jié)合后，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖分子合成，導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡。在對臨床分離亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌株中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥性與青霉素結(jié)合蛋白的改變關(guān)系密切，與細(xì)胞膜通透性改變呈協(xié)同作用[14]。（3）外排系統(tǒng)耐藥是外膜蛋白形成了主動外排系統(tǒng)，開口于外膜的復(fù)合物，可以直接使藥物泵出到細(xì)菌體外。當(dāng)其表達(dá)增高時導(dǎo)致耐藥，目前發(fā)現(xiàn)7種主動外排系統(tǒng)，均屬于RND家族，Mexab-OprM是在銅綠假單胞菌中最先發(fā)現(xiàn)RND家族外排系統(tǒng)，其作用的底物廣泛，最有臨床意義的藥物外排系統(tǒng)[15]。（4）膜的通透性降低：銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜就有分子篩作用，阻止抗菌藥物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。大多數(shù)抗菌藥物根據(jù)分子量的大小通過膜孔蛋白通道進(jìn)入到細(xì)胞。銅綠假單胞菌中與碳青霉碳青霉烯類藥物相關(guān)的膜孔蛋白少，OprD是目前研究發(fā)現(xiàn)引起碳青霉烯類抗生素耐藥膜孔蛋白。OprD膜孔蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一[11]。如果臨床分離到耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌，通常對青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氨基糖苷類類等藥物呈現(xiàn)協(xié)同耐藥[16]，臨床醫(yī)生對此束手無策，到無藥可用的境地，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡率增高，就需要尋找新的治療藥物和新的治療方案。

本實驗數(shù)據(jù)表明兩種藥物聯(lián)合使用的情況下，亞胺培南的藥物濃度平均降低原來的一半，鹽酸小檗堿的藥物濃度從268.80 μg/mL平均降到8.16 μg/mL，根據(jù)檢驗的結(jié)果兩藥聯(lián)合使用與兩藥單獨(dú)使用存在顯著性差異，西藥亞胺培南和中藥鹽酸小檗堿聯(lián)合使用對95%的耐藥菌株具有較理想的抑菌效果；能夠增強(qiáng)彼此的抗菌能力。在譚黎明等[17]研究中說明黃連提取物分別與氨芐西林和頭孢他啶聯(lián)合使用可以降低病人血液培養(yǎng)陽性率；黃連提取物可以提高氨芐青霉素和頭孢菌素治療大鼠銅綠假單胞菌感染的療效。這與本實驗結(jié)果基本相一致，鹽酸小渠堿與藥物合用可以提高藥物的療效，與單用抗生素組比較，差異有顯著性（P<0.01）。同樣在丁彩云等[18]的頭孢哌酮舒巴坦與小檗堿合用治療福氏志賀菌痢疾50例研究中也說明這一觀點，頭孢哌酮舒巴坦與鹽酸小檗堿合用治療有效率為100%，顯著高于單用頭孢哌酮舒巴坦的70%。鹽酸小檗堿對銅綠假單胞菌的抑菌或者殺菌機(jī)制是通過增加細(xì)胞膜的通透性[19]，當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增加時，抗菌藥物就比較容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抗菌效能增加，藥物MIC就會降低。碳青霉烯類藥物和鹽酸小檗堿合用時，其MIC也會降低，與本實驗相符。

綜上，鹽酸小檗堿與亞胺培南聯(lián)合使用抑制銅綠假單胞菌的能力明顯高于單獨(dú)使用鹽酸小檗堿或亞胺培南藥物。為臨床治療耐碳青霉烯銅綠假單胞菌提供理論依據(jù)。鹽酸小檗堿除了增加細(xì)胞膜的通透性以外，可能存在其他的抗菌機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究證實。

[參考文獻(xiàn)]

[1] SHI Qingxin，YE Lihong，XU Chengxin. Carbapenem-resistance mechanism study of pseudomonas aeruginosa isolated from ICU patients[J]. China Modern doctor，2012，50（7）：29-30.

[2] Fournier D，Richardot C，Muller E，et al. Complexity of resistancemechanisms to imipenem in intensive care unit strains of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Antimicrob Chemo-ther，2013，68 （8）：1772-1780.

[3] 胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等. 2013年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中華感染與化療雜志，2014，14（5）：365-374.

[4] 劉萍，向燦輝，鄧鎮(zhèn)濤，等. 黃連鹽酸小檗堿的提取鑒定及抑菌活性研究[J]. 食品與生物，2011，26（1）：3-4.

[5] 王興力，多麗波. 銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬酶及其檢測方法研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（9）：2252-2254.

[6] 李艷敏，駱婷婷，王華富. 大蒜素聯(lián)合頭孢哌酮對多重耐藥鮑曼不動桿菌體外抗菌活性的影響[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生雜志，2013，51（21）：68-69.

[7] 厲世笑，周鵬，朱珊珊，等. 丹參酮聯(lián)合頭孢他啶、哌拉西林鈉他唑巴坦對多重耐藥銅綠假單胞菌的體外抗菌作用的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015 ，25（7）：1096-1097.

[8] Olivares PJ，Alvarez Ortega C，Luis MJ. Metabolic compensation of fitness costs associated with overexpression of the multidrug Ef-flux pump mex EF-OprN in pseudomonas aeruginosa[J]. Antimi-crob Agents Chemother，2014，58（7）：3904-3913.

[9] National committee for clinical laboratory standards（NCCLS）. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically，M100-s24[S]. Pennsylvania：NCCLS，2014.

[10] Sun Y，Li N，Lu Y，et al. In vitro antibacterial activity of allicin in combination with berberine hydrochlo-ride[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，2015，37（12）：2589-2595.

[11] Li MW，Wei LH，MO Shanying，et al. Drug resistance analysis of carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa in general hospitals[J]. Modern Preventive Medicine，2013，40（18）：3454-3456.

[12] 張亦婷，應(yīng)利君，周蕾，等. ICU銅綠假單胞菌耐亞胺培南的危險因素及耐藥機(jī)制研究[J]. 中國消毒學(xué)雜志，2015，32（10）：1052-10534.

[13] Wang J，Zheng XM，Lan HL，et al. Study of drug resistance mechangisms of multidrug-resistance Pseudomons aeruginosa to β-lactams[J]. Chinese Journal of Nosocomiology，2015，25（16）：3620-3623.

[14] 李蘇利，華川. 銅綠假單胞菌多重耐藥及泛耐藥研究進(jìn)展[J]. 山西醫(yī)藥雜志，2013，42（8）：891-892.

[15] 吳祥林，肖麗霞，馬東禮，等. 多重耐藥銅綠假單胞菌Mexab-OprM的表達(dá)及MexR基因的突變[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）：288-290.

[16] Tang HF，Li WL，Liu WD. With overexpression of the multidrug Ef-flux pump mex EF-Opr N in pseudomonas aeruginosa[J]. Chinese Journal of Microecology，2012，24（7）：640-642.

[17] Tan LM，Tang XY，Zhao M，et al. The effect of Chinese traditional medicine（Coptis，Scutellaria baicalensis） on infection wound due to Pseudomonas aeruginos on scald rats[J]. J Hunan Normal Univ（Med Sci），2011，8（1）：79-81.

[18] 丁彩云，張雪娜. 頭孢哌酮舒巴坦與小檗堿合用治療福氏志賀菌痢疾50例[J]. 基層醫(yī)學(xué)論壇，2016，20（3）：321-322.

[19] 王平，夏飛，葉麗華，等. 黃連對銅綠假單胞菌生物學(xué)特性的影響及機(jī)制[J]. 中藥藥理與臨床，2013，29（2）：83-84.

（收稿日期：2016-10-21）