郎福地　郭麗群　孫欣　楊舒奇　孫敬霞　田?！↑S明莉

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，根據干細胞所處的發(fā)育階段可分為胚胎干細胞和成體干細胞，在一定條件下，它可以分化為多種功能細胞。兒童和成人組織中存在的多能干細胞統(tǒng)稱成體干細胞，是組織或器官特異性的干細胞，擁有自我更新、多向分化及高度增殖的潛能，以及集落形成或克隆單位形成能力。近年來的研究，人們發(fā)現子宮內膜存在干細胞，早孕的蛻膜來源于子宮內膜[1]。據此，本研究推測早孕期蛻膜組織也可能存在干細胞，通過流式細胞儀檢測CD34、PDGF-βR、VEGF-R2這些經典干細胞標記物在早孕蛻膜組織的表達含量，采用雙染法、三染法探討其相互關系，旨在探索干細胞在早孕期蛻膜組織的作用。

材料與方法

一、試劑及儀器

1.主要試劑及儀器：FITC Mouse Anti-Human CD34(BD公司，貨號555821)，PE Mouse Anti-Human PDGF ReceptorβBD(100Tests，2.0 ml，原液純度100%，BD公司，貨號558821,批號：6091779，有效期至2021-02-28)，APC Mouse Anti-Human VEGF-R2(100Tests，2.0 ml，原液純度100%，BD公司，貨號560495，批號：5061833，有效期至2016-02-29)，FITC Mouse IgG1 k Isotype control(100Tests，2.0 ml，原液純度100%，BD公司，貨號555748，批號：88030，有效期至2016-06-30)，PE Mouse IgG2a k Isotype control(100Tests，2.0 ml，原液純度100%，BD公司，貨號555574，批號：5064504，有效期至2020-12-31)，膠原酶IV(0.1mg，濃度：0.2%，GIBCO公司，貨號17104019，批號：5153811，有效期至2021-03-31)，DNA酶I (0.1mg，濃度：0.1%，Sigma公司，貨號D5025)，胰酶(100ml，碧云天公司，貨號C0201)，流式細胞儀(BD公司，Canto II型)，其他相關儀器由哈爾濱醫(yī)科大學黑龍江省心肌缺血重點實驗室提供。

2.實驗標本采集：標本為2015年7月—2016年1月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院提取早孕6～8周行人工流產術的早孕蛻膜組織(n=16例，患者年齡在20～35歲且均無內膜疾病病史，近期內無服用激素類藥物史)，提取過程中避免將絨毛組織帶入蛻膜中，立即置入盛有0.9%冷生理鹽水的無菌組織瓶中，低溫保存轉移至實驗室，在超凈臺內將新鮮蛻膜組織用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)反復沖洗,除去血凝塊，經反復沖洗后，顯微鏡下觀察，其制成的病理切片，證實為蛻膜組織。后用此方法獲取組織，經過反復消化獲得蛻膜組織細胞。本實驗經哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核通過。

3.實驗細胞獲?。簶吮緸?015年7月—2015年10月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院選取末次月經及彩超證實為6～8周正常早孕行人工流產手術患者的子宮蛻膜組織，患者年齡在20～35歲且均無子宮內膜疾病相關病史。無菌條件下在手術室取新鮮的蛻膜組織(n=16)，立即置于盛有冷生理鹽水的無菌瓶中，迅速轉移至實驗室，在超凈操作臺中進行原代細胞分離獲得。

二、實驗方法

1.早孕蛻膜組織來源的原代細胞提取及干細胞標志物的檢測：提取的早孕蛻膜組織標本無菌操作臺上經PBS反復沖洗、除去血凝塊，經反復沖洗后，顯微鏡下觀察，其制成的病理切片，證實為蛻膜組織。后用此方法獲取組織，經過反復消化、離心收集蛻膜組織單細胞懸液，通過細胞計數法計數，每組用于流式細胞儀檢測的樣本細胞量為2×106個，置于PBS中吹打混勻。單染法中，采用FITC Mouse Anti-Human CD34，PE Mouse Anti-Human PDGF Receptorβ，APC Mouse Anti-Human VEGF-R2加入對應的同型對照抗體FITC Mouse IgG1 k Isotype control，PE Mouse IgG2a k Isotype control，進行避光孵育30 min；雙染法中采用FITC Mouse Anti-Human CD34 和PE Mouse Anti-Human PDGF Receptorβ抗體進行避光孵育30 min；三染法中采用FITC Mouse Anti-Human CD34 ，PE Mouse Anti-Human PDGF Receptorβ和APC Mouse Anti-Human VEGF-R2進行避光孵育30 min。用500 ul PBS沖洗后，置于離心機中離心(3 000 r，5 min)，去上清；以上過程重復三遍，加入500 μl 1%多聚甲醛進行固定即可上機于流式細胞儀中進行檢測。若不能立即上機檢測，應放置4 ℃冰箱避光保存，48 h內進行檢測。

結　　果

一、CD34、PDGF-βR、VEGF-R2在早孕蛻膜組織的含量

CD34、PDGF-βR、VEGF-R2在早孕蛻膜組織都有表達，其含量分別為(0.81±1.07)%，(9.94±7.36)%，(0.90±1.19)%。見圖1。

二、雙染法觀察

CD34不僅表達于干細胞，而且表達于內皮細胞，因此，本實驗進一步采用雙染法分析早孕蛻膜組織CD34和VEGF-R2的表達含量。CD34+/VEGF-R2+的細胞含量為(0.16±0.1)%，CD34+/ VEGF-R2 -的細胞含量為(0.59±0.61)%。見圖2。

三、三染法觀察在早孕蛻膜組織中CD34、PDGF-βR、VEGF-R2表達的相互關系

CD34+/ VEGF-R2+/ PDGF-βR+的細胞含量為(0.09±0.06)%，CD34+/ VEGF-R2-/ PDGF-βR+表達量為(0.15±0.13)%。(見圖3)。CD34陽性的細胞群中，表現為PDGF-βR+的細胞多數為VEGF-R2陰性的細胞。

圖1　早孕蛻膜組織中CD34、PDGF-βR、VEGF-R2的含量

圖2　早孕蛻膜組織中CD34、VEGF-R2相互關系

圖3　早孕蛻膜組織中CD34、PDGF-βR、VEGF-R2 表達的相互關系

討　　論

CD34最早于1984年發(fā)現于造血干細胞和祖細胞[2]。臨床應用方面，它與骨髓移植后的造血干細胞富集及選擇有關，檢測CD34的表達，可以評估骨髓的快速移植效果，并且CD34表達與高集落形成率和長期增殖能力有關[2]。Schwab等[3]通過收集從胎兒到絕經后婦女子宮內膜組織，發(fā)現子宮內膜組織基底層間質細胞終生持續(xù)表達CD34。CD34+細胞存在于人蛻膜組織中，也表達于血管內皮細胞。研究發(fā)現，蛻膜組織提取的CD34+細胞在合適的細胞因子存在時可體外誘導分化為成熟的NK細胞，在誘導分化之前CD34+細胞不具備NK細胞的特性，說明蛻膜組織提取的CD34+細胞存在干細胞的特性，為蛻膜組織的干細胞[4]。蛻膜NK細胞(dNK細胞)是一群獨特型的淋巴細胞群，dNK細胞從子宮內膜分泌期開始增加,在妊娠成功后，dNK細胞持續(xù)存在孕早期蛻膜中,其中底蛻膜上含量最多，妊娠20周以后，滋養(yǎng)層細胞向蛻膜的侵蝕已經完成, 此時dNK細胞的數量開始明顯下降, 至孕晚期完全消失[5]。僅在妊娠早期出現大量dNK 細胞，這一現象提示可能與子宮內膜的蛻膜化以及胚胎滋養(yǎng)層的侵入有關[6]。dNK細胞在妊娠過程中的功能尚不十分明確。但研究證實, 正常妊娠早期, NK細胞大量浸潤子宮蛻膜,并與著床處的胎盤滋養(yǎng)層細胞緊密接觸、相互識別, 對胚胎植入、早期胎盤形成以及胎兒生長發(fā)育可能起調節(jié)作用[7]。

在血管生成方面，dNK 細胞可直接分泌血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PIGF)、促血管生成素1、促血管生成素 2、轉化生長因子-β1(TGF-β1)等促進血管生長[8-9]；通過產生粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，與滋養(yǎng)層細胞上的受體相互作用, 使滋養(yǎng)細胞轉化為合體細胞, 釋放出胎盤生乳素和絨毛膜促性腺激素，從而加速胚胎向內膜層的種植，GM-CSF還能抑制NK 細胞的排異功能,減少流產的發(fā)生。dNK細胞還可通過活化受體NKp30和NKp44與蛻膜基質細胞和絨毛滋養(yǎng)層細胞上特異性配體的相互作用參與促血管生成因子的分泌。除此之外，dNK細胞的受體KIR2DL4(其特異配體為可溶性HLA-G)可誘導促血管生成細胞因子的產生[10]。KIR2DL4可表達于細胞表面和胞內，可溶性 HLA-G 可由絨毛膜滋養(yǎng)層分泌，因此，這種受體-配體的結合可能有助于妊娠早期母體血管的重塑[11]。最新研究發(fā)現CD3-CD56brightCD25+dNK 細胞亞型通過分泌IL-8、IFN-γ在螺旋動脈重塑過程中發(fā)揮始動作用[12]。

從胚胎植入到分娩生產的整個妊娠過程，細胞因子始終發(fā)揮著重要的作用。dNK 細胞分泌的TGF-β可限制滋養(yǎng)層細胞過度侵蝕，白血病抑制因子(LIF)可啟動胚泡著床必需的細胞因子，GM-CSF調節(jié)胚胎植入和胎盤的生長發(fā)育，IL-15R是蛻膜NK細胞分化增殖的重要因子，IFN-γ則是維持蛻膜正常發(fā)育的重要因素。dNK 細胞分泌的干擾素誘導蛋白-10(IP-10) 趨化因子、白細胞介素-8(IL-8)，通過與滋養(yǎng)層細胞上的配體CXCR1 和CXCR3 相互作用，促進絨毛外滋養(yǎng)層細胞遷移到底蛻膜[11]，導致螺旋動脈的浸潤，從而有助于胎盤發(fā)育和妊娠結局；而活化的dNK 細胞受體通過產生GM-CSF溶解因子，有助于滋養(yǎng)層細胞的遷移。內皮血管生成和滋養(yǎng)細胞的遷移則依賴于dNK 細胞的鞘氨醇信號通路調節(jié)[13]。

綜上所述，dNK 細胞作為母-胎界面主要的免疫細胞，其數量變化、功能失調等均會打破母胎界面的平衡狀態(tài)，導致妊娠早期陰道流血、胚胎發(fā)育異常、壞死、流產、胎盤植入、宮內生長受限、子癇前期等發(fā)生，給家庭、社會造成重大影響。

在體情況下蛻膜的CD34+細胞到底發(fā)揮哪些作用，其細胞的含量以及相關的細胞標志物目前均屬空白。本實驗推測通過研究蛻膜中CD34+細胞含量，有可能進一步反映dNK細胞功能狀態(tài)與妊娠的關系，并且CD34+細胞可能作為干細胞在蛻膜的生理變化中發(fā)揮重要的作用[4]。因此，深入研究早孕期蛻膜的CD34+細胞，無疑從一個全新的干細胞角度探索妊娠早孕期復雜的蛻膜變化，有利于詮釋妊娠早孕期的免疫、蛻膜血管生長、胎盤形成的這一生理現象，為揭示病理性妊娠在早孕期的發(fā)生機制及最終有效防治提供新的思路，并為生殖免疫的發(fā)展提供了新的理論依據。

血小板源性生長因子(PDGF)早在70年代由ROSS在研究創(chuàng)傷愈合與動脈粥樣硬化時首先發(fā)現，人體多種組織均有分布，可參與多種生理、病理功能的調節(jié)[14]。PDGF作為細胞的促有絲分裂劑[15]，在細胞遷移、血管形成、組織損傷及修復中起到重要作用[16]，有研究發(fā)現PDGF有刺激血管內皮細胞和平滑肌細胞增殖與遷移，從而促進新生血管形成的作用；此外，PDGF在胚胎期血管、神經、骨骼等系統(tǒng)的器官發(fā)育中起著重要的作用[17]。PDGF受體有兩種，即PDGF受體-α和PDGF受體-β(CD140b)。有研究證實PDGF-βR是子宮內膜干細胞的標志物之一。Schwab等[3]利用CD146 和PDGF-βR(CD140b)從子宮內膜中分離出具有間充質干細胞(MSC)表型和特性的間質細胞。用該方法分離得到的CD146+和PDGF-βR+細胞具有多分化潛能，并且分布在功能層和基底層的血管周圍，表達與血管形成相關的基因。

本實驗通過流式細胞儀檢測早孕蛻膜組織中PDGF-βR+細胞表達，發(fā)現其含量為(9.94±7.36)%。有研究證明與骨髓間充質干細胞相比，子宮內膜干細胞具有27倍更高水平的PDGF-BB，和14倍更高水平的血管生成素。這表明子宮內膜干細胞可激活血管生成途徑[18]。Saji等[19]研究發(fā)現PDGF-BB及其受體PDGF-βR存在于早孕期蛻膜組織中，且PDGF-BB能以劑量依賴方式促進蛻膜細胞DNA合成，參與早孕期子宮間質細胞蛻膜化作用，PDGF還可以誘導人子宮內膜蛻膜細胞、上皮細胞和子宮螺旋動脈平滑肌細胞增殖，促進胚胎植入。蛻膜來源于子宮內膜，蛻膜中含有的PDGF、PDGF-βR含量可能比骨髓等組織含有的量更多。在血管生成過程中，PDGF-BB能誘導內皮細胞增殖，遷移，促進結構形成和細胞存活，聚集周細胞以促進血管結構的完整性[20-21]，誘導血管平滑肌細胞及臍靜脈內皮細胞表達VEGF[22-23]。PDGF-BB表達水平降低，致絨毛血管結構發(fā)育不良，血管生成受阻，血管數目減少，形態(tài)異常，血管滲透性增加，是胎兒胎盤單位灌注不足，胎盤缺血缺氧，從而導致流產發(fā)生，對孕產婦及家庭產生深遠影響。

血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cell,EPC)，是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內皮細胞,但尚未表達成熟血管內皮細胞表型，也未形成血管的前體細胞。在胚胎發(fā)育過程中 ,血液與血管的發(fā)生密切相關,在鼠胚7.5日齡, 胚外卵黃囊出現造血島,造血島中心是呈圓形的造血干細胞,而周邊的細胞則分化為伸展的血管內皮細胞。這種發(fā)育上的時空聯(lián)系,以及造血細胞與血管內皮細胞共同具有的眾多細胞表面標記( 如 CD34 、VEGFR-2 等)使人設想這兩者可能來自共同的中胚層前體細胞-血液血管干細胞。近十年來的研究發(fā)現,外周血中存在造血干/祖細胞,這使 Asahara等[24]推想外周血中也可能存在EPC，人外周血CD34+或 VEGFR-2+細胞在體外能增殖并轉化為血管內皮細胞。

CD34 作為富集造血干/祖細胞的主要標記,也表達于胚胎早期血管上,因而可用于富集 EPC 。VEGFR-2(即鼠的 Flk-1 ,人的KDR)作為胚胎血液血管發(fā)育時的關鍵受體,是血液血管干細胞的表面標記,在出生后也同時表達于早期造血干細胞和成熟血管內皮細胞上。以上不同富集EPC方法所得皆為異質性群體,其本質部分為 VEGFR-2+細胞組份。血管內皮細胞分化過程對VEGF的絕對依賴性也反映了作為VEGF主要信號傳導受體的 VEGFR-2 在血管內皮細胞不同分化階段表達的必然性。然而,即使是CD34+/VEGFR-2+也包含了最原始的造血干細胞[24]。

CD34不僅表達于干細胞，而且表達于內皮細胞，VEGF-R2的表達陽性還存在于內皮細胞以及一些祖細胞。因此，本實驗進一步采用雙染法分析早孕蛻膜組織CD34和VEGF-R2的表達含量。發(fā)現CD34+/VEGFR2+含量為(0.16±0.1)%， CD34+/ VEGF-R2-含量為(0.59±0.61)%，早孕蛻膜組織中的CD34+細胞群可能既含有內皮細胞，又含有祖細胞、干細胞。

本實驗通過流式細胞儀檢測早孕蛻膜組織中CD34+細胞群中PDGF-βR表達，發(fā)現CD34+/ VEGF-R2+/ PDGF-βR+的細胞含量為(0.09±0.06)%，CD34+/ VEGF-R2-/ PDGF-βR+表達量為(0.15±0.13)%。二者對比可以看出CD34+細胞群中更多的是VEGF-R2-細胞表達PDGF-βR，差異盡管無統(tǒng)計學意義，但可能與樣本量不夠大有關，這類含量為(0.15±0.13)%的CD34+/ VEGF-R2-/ PDGF-βR+細胞群很有可能是一類具有特殊作用具有分化潛能的干細胞群。在血管生成過程中，PDGF-BB能誘導內皮細胞增殖、遷移，促進結構形成和細胞存活，聚集周細胞以促進血管結構的完整性[20-21]，誘導血管平滑肌細胞及臍靜脈內皮細胞表達VEGF，因此，這類干細胞群可能與血管形成作用相關。

總之，本研究證實在早孕期蛻膜組織存在一定含量經典干細胞標志物CD34、PDGF-βR、VEGF-R2陽性的細胞群，并且采用雙染法及三染法證實上述標志物陽性表達的內在含量關系。本實驗推測，表達這些經典干細胞標志物的細胞群為蛻膜組織存在的干細胞，并可能與蛻膜血管的發(fā)生發(fā)展相關，進而從一個新的視角探索早孕期蛻膜組織的生理過程，其異常可能與部分妊娠過程異常如胚胎停育、胎盤功能不良等相關，這為進一步的蛻膜干細胞研究提供了研究依據。深入探討早孕蛻膜組織中的干細胞的含量及作用，明確其在妊娠中的機制，有助于深化對人類妊娠的了解，對病理妊娠和其他妊娠相關疾病的機制及有效防治提供新思路，將有助于女性更好的妊娠及胎兒的孕育。

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