田甜　張繼　靳蕾　王琳琳　任愛國

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)是在胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合不全引起的一組缺陷[1]。我國是出生缺陷高發(fā)國家，2014年山西省NTDs患病率達(dá)31.5/萬[2]。NTDs由環(huán)境和遺傳因素共同引起[3]，遺傳因素占50%以上[4]。平面細(xì)胞極化信號通路(PCP通路)基因突變與神經(jīng)管缺陷的關(guān)聯(lián)近年來受到較大關(guān)注[5]。Scribble/Scrib基因是PCP通路相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)，Scrib插入突變使小鼠產(chǎn)生卷尾表型[6]。Robinson等[7]及Lei等[8]分別在顱脊柱裂和脊柱裂患者中檢測到SCRIB基因的突變。然而，既往研究均以血液為標(biāo)本，缺乏對病變處組織突變情況及是否存在體細(xì)胞突變的研究。

體細(xì)胞突變(somatic mutation)指生物體內(nèi)除生殖細(xì)胞外的體細(xì)胞發(fā)生的突變，不從父母遺傳獲得，只發(fā)生在子代特定器官組織中，不造成后代遺傳改變[9]。體細(xì)胞突變理論最早應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，隨著生物技術(shù)的提高，逐步應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)[10]、心臟[11]和腎臟疾病[12]等疾病的病因解釋。目前國內(nèi)外尚沒有NTDs與體細(xì)胞突變關(guān)系的研究。本研究選取了中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變處組織和臍帶組織，將二代測序技術(shù)與Sanger法測序結(jié)合，旨在篩選SCRIB基因體細(xì)胞突變，同時選取來自不同胚層的多個器官組織，探討突變分布情況，為NTDs的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

對象與方法

一、對象

本研究的研究對象募集自山西省平定、澤州、昔陽、壽陽、太谷5個縣[13]。樣本收集時間為2011年3月—2011年11月。納入條件為：產(chǎn)前診斷引產(chǎn)的NTDs的胎兒；母親為山西省常住居民(在本地居住2年以上)，且本次妊娠期間在本地居??；漢族人群；胎兒不合并其他系統(tǒng)缺陷；同意參加研究并簽署書面知情同意書。排除條件包括：母親患有慢性疾病如糖尿病、癲癇等；母親患有嚴(yán)重妊娠合并癥如妊娠期高血壓、先兆子癇等；最近1個月服用藥物如抗癲癇藥物等；胎兒病變類型不明確的及病變部位不明確的。本研究第一步納入28名患兒篩選NTDs相關(guān)的SCRIB突變位點，然后納入另一組51例患兒進(jìn)行驗證測序。本研究已經(jīng)過北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

樣本來自同一患兒的病變處組織和正常對照組織，引產(chǎn)胎兒排出2 h內(nèi)，病理科醫(yī)生按照尸體解剖操作規(guī)范，對引產(chǎn)胎兒進(jìn)行尸體解剖，無菌條件下取材，主要取胎兒脊柱病變處、腦組織病變處，同時取表皮、心臟、腎、胸腺、肝等正常組織，收集保存胎兒胎盤和臍帶組織。

二、方法

1. DNA提取：在4℃環(huán)境下取患兒的病變處、皮膚、心臟、肌肉、胸腺、肺和臍帶組織25 mg，按QIAamp DNA Mini Kit tissue試劑盒操作流程提取組織DNA；采用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)檢測DNA濃度，于-80℃保存DNA。

2. PGM測序：將提取出的DNA跑電泳檢測其降解程度，如無降解，將基因組稀釋至5 ng/μl。采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0試劑盒建立樣品文庫、連接接頭和純化DNA文庫。采用Ion PGM Hi-Q OT2 Kit試劑盒，在Ion OneTouchTM2 System儀器上進(jìn)行油包水反應(yīng)。在Ion OneTouch ES儀上富集陽性模板，并收集待測樣品。采用Ion PGM Hi-Q Sequencing Kit、Ion PGM Wash 2 Bottle Kit及Ion 318TMChip Kit v2 BC (8 rxns)試劑盒在318TM芯片上進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用PGM平臺自帶的Torrent SuiteTMSoftware軟件進(jìn)行結(jié)果初篩，并上傳至Life tech 公司的Ion Reporter數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行測序結(jié)果多重分析。

3. Sanger測序：以目標(biāo)位點上下游各300 bp為目標(biāo)基因片段，使用NCBI/Primer-BLAST在線工具設(shè)計PCR引物，其序列為：1-上游引物：5’-CCCCAGATCCTCACCCTCATA-3’，1-下游引物：3’- CCCAACGCCTGCTGACTGT-5’； 2-上游引物：5’-GCTGACACCAACCTTGACAG-3’，2-下游引物：3’-CCTCACCCTTTTGTCCGCA-5’。PCR反應(yīng)容積為50 nl，每一反應(yīng)體系中含2×Taq PCR Green Mix 25 μl，ddH2O 15 μl，上、下游引物各2 μl，模板DNA 6 μl(20 ng/μl)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 12 min(94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)37個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ hold。將產(chǎn)物送往北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行sanger測序。

4.數(shù)據(jù)分析：參考dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(www.1000genome.org)和ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)檢測到的突變是否為新發(fā)突變。采用SIFT在線預(yù)測工具(http://sift.jcvi.org/)及PolyPhen2軟件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響。采用Clustal-Omega 1.2.1軟件估計突變位點編碼的蛋白質(zhì)物種間保守性。采用Mutation Surveyor 4.0.8軟件，將Sanger測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫參考序列做比對。將病變組織檢測到而正常組織未檢測到的突變定義為體細(xì)胞突變[14]，由于臍帶是胚胎發(fā)育過程中胎兒最早發(fā)育的組織，將其作為正常對照組織。

結(jié)　　果

一、PGM測序結(jié)果及突變功能預(yù)測

對28名NTDs患兒的病變處進(jìn)行PGM測序，分別在編號為A6和A2的患兒病變處檢測到SCRIB基因的2個突變位點(c.1931G>C和c.1265C>T)，本次測序覆蓋度均達(dá)到97%以上，平均測序深度均達(dá)到300以上。如圖1所示，A6測序深度達(dá)721.8，覆蓋率達(dá)97.29%；A2測序深度為457.3，覆蓋率達(dá)98.83%，測序結(jié)果良好。

圖1　PGM測序覆蓋率和測序深度圖

與參考數(shù)據(jù)庫對比，c.1931G>C和c.1265C>T位點均不是新發(fā)突變。運用SIFT和PolyPhen2進(jìn)行突變功能預(yù)測，c.1931G>C突變不影響蛋白功能，為良性突變；c.1265C>T影響蛋白功能，為有害突變，見表1。保守性估計結(jié)果見圖2，突變位點c.1931G>C編碼的蛋白質(zhì)在人、狗、小鼠、大鼠等哺乳動物中具有保守性；c.1265C>T突變位點編碼的蛋白質(zhì)在人與狗中具有高度保守性。

表1　 28名患兒PGM測序結(jié)果

注：突變率表示檢測到突變位點的次數(shù)占所有檢測次數(shù)的百分比。SIFT功能預(yù)測評分<0.05表示該突變影響蛋白功能；>0.05該突變不影響蛋白功能。Polyphen評分0.957～1為有害；0.453～0.956可能有害；0～0.452無害

二、Sanger法驗證病變處及其他組織中突變情況

取A6和A2患兒的臍帶，同時取外胚層的皮膚，中胚層的心臟和肌肉、內(nèi)胚層的胸腺和肺，對其進(jìn)行Sanger法測序。在A6患兒病變處檢測到c.1931G>C突變，在臍帶組織中未檢測到突變，在皮膚、心臟、肌肉、胸腺和肺組織中均檢測到c.1931G>C突變。在A2患兒的病變處檢測到c.1265C>T突變，而在臍帶、皮膚、心臟、肌肉、胸腺和肺組織中均未檢測到該突變。A2與A6病變處的突變(c.1931G>C和c.1265C>T)均不由父母遺傳而來，為體細(xì)胞突變，見圖3。

圖2　SCRIB基因兩個突變位點的保守性估計

圖3　體細(xì)胞突變的樣本的Sanger測序結(jié)果

三、擴(kuò)大樣本量研究

另外納入51名NTDs患兒，采用Sanger法，在其病變組織中針對PGM測序篩選出的突變位點進(jìn)行驗證測序。在51名患兒病變處中均未檢測到c.1931G>C突變；在51名患者中，有5名患者病變處檢測到c.1265C>T突變，進(jìn)一步對該5名患者的其他組織進(jìn)行測序，在其他組織中均檢測到c.1265C>T突變，且不同胚層之間突變情況一致，提示該5名的c.1265C>T突變可能由父母遺傳而來，見表2。

表2　 擴(kuò)大樣本量驗證結(jié)果

注：EN腦膨出；SB脊柱裂

討　　論

本研究以SCRIB基因為目標(biāo)基因，在第一階段的28名NTDs患兒中檢測到2個體細(xì)胞突變位點(c.1931G>C和c.1265C>T)。在51例NTDs患兒中驗證測序檢測到5例c.1265C>T突變病例。本研究提示NTDs的發(fā)生與SCRIB基因突變有關(guān)聯(lián)，尤其是SCRIB基因的體細(xì)胞突變。

平面細(xì)胞極化信號通路(PCP通路)，最先在果蠅翅膀遠(yuǎn)端體毛中發(fā)現(xiàn)[15]。對于哺乳動物建立和維持細(xì)胞極化方向起重要作用[16]。當(dāng)前已有多項動物模型和人群測序表明PCP通路相關(guān)基因與NTDs的發(fā)生有關(guān)[1]。SCRIB基因是PCP通路相關(guān)基因，其調(diào)控細(xì)胞質(zhì)多模塊支架蛋白，對于上皮組織極化有重要作用[17]。Scrib1基因突變導(dǎo)致小鼠卷尾，其和Vangl2基因在功能上存在交叉[18]。Robinson等[7]通過對36名顱脊柱裂患兒測序，在其中2名患兒中分別檢測到2個雜合突變(c.1360C>T和c.4604G>A)，其中c.4604G>A為有害突變。Lei等[8]192里脊柱裂患兒中檢測到3個SCRIB有害突變(c.3128C>T、c.3995C>T和c.4995T>G)，其突變蛋白均胞質(zhì)定位異常，提示SCRIB基因為神經(jīng)管缺陷的病因之一。然而，既往研究均注重于檢測血液中的突變情況，病變組織是否存在同樣突變，缺乏研究數(shù)據(jù)。患兒的突變可能遺傳自父母，也可能為新發(fā)突變。由于絕大多數(shù)神經(jīng)管缺陷患兒的父母均表型正常，因此，患兒新發(fā)突變致病，特別是體細(xì)胞突變的可能是存在的。

同一個機(jī)體的病變組織有突變而其他正常組織無突變，提示為體細(xì)胞突變[19]。當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞突變在腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生中具有重要作用。Muotri等[10]發(fā)現(xiàn)，人類L1元件可以導(dǎo)致小鼠神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞突變，從而影響神經(jīng)元連接，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。神經(jīng)管缺陷作為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病，本研究推測體細(xì)胞突變可能在NTDs的發(fā)生過程中起到一定作用。

本研究在2例患兒病變組織中分別檢測到SCRIB基因的2個突變(c.1931G>C和c.1265C>T)而在其臍帶中未檢測到該突變，提示該兩個突變?yōu)轶w細(xì)胞突變。其中c.1931G>C為良性突變，不影響蛋白功能，而c.1265C>T為有害突變，影響蛋白功能的表達(dá)。保守性估計結(jié)果表明，以上突變位點在哺乳動物中保守，對于哺乳動物有重要作用。同時，對于其他胚層的皮膚、肌肉、胸腺、肺和心臟組織測序，該組織中均存在c.1931G>C突變，而未檢測到c.1265C>T突變，提示以上兩個體細(xì)胞突變發(fā)生部位和時期不同。在擴(kuò)大的樣本量病變組織中均未檢測到c.1931G>C突變，有5例患兒病變處檢測到c.1265C>T突變，但是該突變在同樣患兒的臍帶和其他組織中也均檢測到，提示突變來自父母。本研究共納入79例NTDs患兒，其中1例發(fā)生c.1931G>C體細(xì)胞突變，突變發(fā)生率為1.26%，明顯大于參考數(shù)據(jù)庫中亞洲人群該位點突變發(fā)生率(0.19%)，另1例發(fā)生c.1265C>T體細(xì)胞突變。同時有5例在病變處和臍帶均發(fā)生了c.1265C>T突變，提示為種系突變，該位點突變頻率小于亞洲人群發(fā)生頻率，提示為基因多態(tài)性變異。結(jié)合SCRIB基因在神經(jīng)管形成過程中調(diào)控細(xì)胞極化的重要作用，本研究結(jié)果提示，SCRIB基因的體細(xì)胞突變可能與NTDs發(fā)生有關(guān)。

本研究采用了PGM測序和Sanger法結(jié)合的方式進(jìn)行測序。PGM測序為二代測序，利用了半導(dǎo)體芯片技術(shù)，可針對目標(biāo)基因進(jìn)行靶向測序，靈敏度較Sanger測序大大增加，并可大規(guī)模同時精確測序[20]。本次PGM測序結(jié)果覆蓋度均達(dá)到97%以上，平均測序深度均達(dá)到300以上，表明測序良好。

本研究首次探討了NTDs患者的不同組織突變情況，在NTDs患兒中檢測到SCRIB基因的體細(xì)胞突變，為NTDs遺傳學(xué)機(jī)制提供新的思路。但是本研究僅在人群中進(jìn)行了驗證，新發(fā)的突變位點對于神經(jīng)管缺陷發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，以及其是否和PCP通路其他基因之間存在交互作用，有待進(jìn)一步實驗進(jìn)行驗證。

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