朱衛(wèi)金，潘美珍，張麗娜

(常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213000)

青霉素敏感攜帶blaZ基因金黃色葡萄球菌幾種表型檢測方法比較

朱衛(wèi)金，潘美珍，張麗娜

(常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213000)

目的 評估“四葉草”試驗(yàn)、K-B紙片法、頭孢硝噻吩顯色法、青霉素抑菌圈邊緣試驗(yàn)4種方法檢測青霉素敏感金黃色葡萄球菌blaZβ-內(nèi)酰胺酶基因的能力。方法 以PCR法擴(kuò)增blaZβ-內(nèi)酰胺酶基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，評估“四葉草”試驗(yàn)、K-B紙片法、頭孢硝噻吩顯色法、青霉素抑菌圈邊緣試驗(yàn)4種方法檢測28株青霉素最低抑菌濃度(MIC)≤0.12 μg/mL的金黃色葡萄球菌中產(chǎn)酶株的能力。結(jié)果 28株菌株經(jīng)PCR法擴(kuò)增出7株blaZ陽性株，經(jīng)“四葉草”試驗(yàn)、頭孢硝噻吩顯色法和青霉素抑菌圈邊緣試驗(yàn)分別檢出5株、2株和3株，檢出率分別為17.86%、7.14%和10.71%；21株blaZ陰性菌株經(jīng)上述試驗(yàn)檢測均為陰性。K-B紙片法抑菌圈直徑均≥29 mm，blaZ陽性株平均直徑32.43 mm(范圍29～35 mm)，blaZ陰性株平均直徑38.81 mm(范圍32～45 mm)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.58，P<0.05)。結(jié)論 檢測金黃色葡萄球菌是否對青霉素敏感的常規(guī)表型測試法結(jié)果不完全可靠。

青霉素；金黃色葡萄球菌；β-內(nèi)酰胺酶；blaZ

目前從人體感染部位分離的金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率已經(jīng)超過了90%[1]。臨床常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法比如紙片擴(kuò)散法、儀器法等檢出的金黃色葡萄球菌對青霉素的試驗(yàn)結(jié)果不完全準(zhǔn)確，其中攜帶blaZ基因的菌株有可能被報(bào)告成敏感，易造成臨床用藥的誤區(qū)。為探索這一問題，本研究用PCR法擴(kuò)增blaZ基因結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較實(shí)驗(yàn)室常用的幾種表型檢測方法的優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集常州市中醫(yī)醫(yī)院2011年1月至2016年6月臨床分離的經(jīng)Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套GP67板卡檢測青霉素最低抑菌濃度(MIC)≤0.12 μg/mL的非重復(fù)金黃色葡萄球菌 28株，其中分泌物21株，腹腔引流液5株，痰液2株。金黃色葡萄球菌ATCC 25923、ATCC 29213為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器 Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定藥敏儀及配套GP67卡、M-H 培養(yǎng)基(法國生物梅里埃公司)；青霉素藥敏紙片(10 U)、頭孢硝噻吩紙片(Oxoid公司)；ABI 7500 PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)；凝膠成像儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)；2×Taq Master Mix和DNA marker(大連寶生物工程公司)；瓊脂糖(上海生工生物公司)；引物由上海生工生物公司合成。

1.3blaZ基因檢測 采用加熱煮沸法提取菌株DNA作為PCR模板。參照文獻(xiàn)[2]合成blaZ基因引物，上游引物5′-CAAAGATGATATAGTTGCTTATT

CTCC-3′，下游引物5′-TGCTTGACCACTTTTATCAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為421 bp。總體系50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2× Taq Master Mix 25 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。ATCC 25923和ATCC 29213分別作為blaZ基因擴(kuò)增中的陰、陽性對照。PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物由上海生工公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析以確定基因型。

1.4 “四葉草”試驗(yàn)[2]調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌ATCC 25923至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，均勻涂布M-H瓊脂平板，在平板中央貼上10 U青霉素紙片，用接種環(huán)挑取待測菌自紙片邊緣向平板邊緣劃線接種。35 ℃培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，若青霉素抑菌圈處出現(xiàn)矢狀生長則提示待測菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分別作為陰、陽性對照。

1.5 K-B紙片法檢測及抑菌圈邊緣試驗(yàn) 采用K-B法，按照CLSI M100-26[3]，待測菌株用生理鹽水調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鶆蛲坎加贛-H瓊脂平板，并在平板中央貼10 U青霉素紙片，置于35 ℃培養(yǎng)16～18 h，游標(biāo)卡尺記錄青霉素抑菌圈直徑。由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的微生物工作者觀察上述測試青霉素紙片抑菌圈邊緣，呈光滑“絕壁樣”提示產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，若邊緣呈模糊“海灘樣”則提示不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分別作為K-B法的陰、陽性質(zhì)控菌株。

1.6 頭孢硝噻吩顯色法 參照紙片說明書，用一滴無菌去離子水將頭孢硝噻吩紙片浸濕，取青霉素抑菌圈邊緣細(xì)菌直接涂布于濕潤的紙片上，觀察紙片顏色，若1 h內(nèi)紙片由黃變紅為陽性，若不變色為陰性。金黃色葡萄球菌ATCC 25923和ATCC 29213分別作為陰、陽性質(zhì)控。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。blaZ陽性組和blaZ陰性組青霉素抑菌圈直徑大小比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測結(jié)果 28株金黃色葡萄球菌中，blaZ陽性7株，blaZ陰性21株。見圖1。

注：M，DNA marker；1，金黃色葡萄球菌ATCC 29213；2～5為blaZ陽性菌株；6，金黃色葡萄球菌ATCC 25923；7、8為blaZ陰性菌株。

圖1 PCR擴(kuò)增blaZβ-內(nèi)酰胺酶基因凝膠電泳分析

2.2 “四葉草”試驗(yàn)及頭孢硝噻吩顯色試驗(yàn)結(jié)果 7株blaZ陽性金黃色葡萄球菌“四葉草”試驗(yàn)檢出5株陽性，2株陰性；頭孢硝噻吩顯色試驗(yàn)檢出2株陽性，5株陰性。21株blaZ陰性株“四葉草”試驗(yàn)及頭孢硝噻吩顯色試驗(yàn)均陰性。2種試驗(yàn)的特異性均為100%。

2.3 青霉素抑菌圈直徑及抑菌圈-邊緣試驗(yàn)結(jié)果 28株菌抑菌圈直徑均大于29 mm。blaZ陽性株直徑范圍為29～35 mm(平均32.43 mm)，blaZ陰性株為32～45 mm(平均38.81 mm)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.58，P<0.05)。青霉素抑菌圈邊緣試驗(yàn)結(jié)果顯示，7株blaZ陽性菌株中5株3位觀察者均判為光滑型；21株blaZ陰性菌株中有3株菌同時(shí)被3位觀察者認(rèn)為是光滑型。

3 討論

本研究從28株菌中擴(kuò)增出7株含有blaZ基因，檢出率為25%。目前，金黃色葡萄球的藥敏試驗(yàn)大都采用儀器法，儀器檢測的青霉素MIC≤0.12 μg/mL的菌株，加做頭孢硝噻吩試驗(yàn)敏感性不高，這可能也是CLSI 2016規(guī)定需要觀察青霉素紙片抑菌圈邊緣的形狀來判斷是否真正敏感的原因。“四葉草”試驗(yàn)雖敏感性相對較高，但其需要培養(yǎng)16～18 h才能觀察結(jié)果。K-B紙片擴(kuò)散法優(yōu)點(diǎn)為操作簡單、方便、成本低，本試驗(yàn)所選的28株菌抑菌圈直徑全部≥29 mm，blaZ陽性菌株與blaZ陰性菌株抑菌圈直徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與Kaase等[4]的結(jié)果相同。但更改和重新界定折點(diǎn)還需要大量的檢測數(shù)據(jù)和臨床療效觀察。用Vitek 2 Compact儀器配套GP67卡檢測葡萄球菌屬對青霉素MIC的檢測范圍為0.03～0.5 μg/mL，所以不能報(bào)告超出檢測范圍的blaZ陽性菌株和blaZ陰性菌株對青霉素的具體MIC值，也就失去了根據(jù)MIC值推測是否存在blaZ基因的依據(jù)。抑菌圈邊緣觀察試驗(yàn)存在一定的人為誤差。本次試驗(yàn)中3名有經(jīng)驗(yàn)的微生物人員在7株blaZ陽性菌株中一致判定5株是邊緣光滑型，與PCR法比較一致性較高(71.43%)，也是CLSI 2016推薦的方法；但仍有3株blaZ陰性菌株被3位觀察者認(rèn)為是邊緣光滑型，通過加強(qiáng)操作和判斷方法的培訓(xùn)應(yīng)該可減少這種誤判。對于青霉素敏感率較高的地區(qū)或患者，如基層醫(yī)療單位和社區(qū)獲得性感染的患者，提前加做“四葉草”試驗(yàn)，可以縮短報(bào)告時(shí)間，微生物實(shí)驗(yàn)室可適當(dāng)考慮。

[1]Chambers HF, Deleo FR. Waves of resistance:Staphylococcusaureusin the antibioticera[J]. Nat Rev Microbiol, 2009, 7(9): 629-641.

[2]El Feghaly RE, Stamm JE, Fritz SA,etal. Presence of theblaZbeta-lactamase gene in isolates ofStaphylococcusaureusthat appear penicillin susceptible by conventional phenotypic methods[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2012, 74(4): 388-393.

[3]CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-sixth informational supplement. M100-26[S]. Wayne, PA：CLSI, 2016.

[4]Kaase M, Lenga S, Friedrich S,etal. Comparison of phenotypic methods for penicillinase detection inStaphylococcusaureus[J]. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(6): 614-616.

(本文編輯：周萬青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.12

朱衛(wèi)金，1983年生，男，碩士，主管技師，主要從事微生物檢驗(yàn)工作。

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2016-11-16)