黃旭，劉成成，徐婷，唐晨杰，夏文穎，倪芳，王芳，劉根焰

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用評價(jià)*

黃旭，劉成成，徐婷，唐晨杰，夏文穎，倪芳，王芳，劉根焰

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

目的 評估Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 選取43份腹瀉糞便標(biāo)本，采用厭氧培養(yǎng)法、VIDAS檢測A/B毒素法和Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)檢測艱難梭菌，以產(chǎn)毒培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)對檢測方法進(jìn)行評價(jià)，并比較不同檢測方法對臨床標(biāo)本檢測結(jié)果的一致性。通過自配027型標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬糞便標(biāo)本，驗(yàn)證Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)篩選027型流行株的能力。結(jié)果 以產(chǎn)毒培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的敏感性和特異性分別為90.9%和93.8%，陽性和陰性預(yù)測值分別為 83.3%和96.8%。與產(chǎn)毒培養(yǎng)法結(jié)果一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.822(P<0.05)，與VIDAS檢測A/B毒素法結(jié)果一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.419(P<0.05)；027型標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬糞便標(biāo)本檢測結(jié)果陽性并報(bào)告為027型。結(jié)論 Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)能夠快速準(zhǔn)確地檢測糞便標(biāo)本中的艱難梭菌相關(guān)基因，且能準(zhǔn)確報(bào)告027型高產(chǎn)毒力菌株。

艱難梭菌；Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)；產(chǎn)毒培養(yǎng)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種專性厭氧的革蘭陽性粗大芽胞桿菌，屬腸道條件致病菌，其感染可以導(dǎo)致輕中度腹瀉、偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis，PMC)甚至中毒性巨結(jié)腸[1]。近年來，我國艱難梭菌的感染率逐年上升，院內(nèi)感染相關(guān)腹瀉患者平均感染率為14%，部分地區(qū)高達(dá)23%，且歐美地區(qū)流行的027型高產(chǎn)毒力菌株也在國內(nèi)多個地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[2]。因此，積極開展艱難梭菌檢測新技術(shù)非常重要。

艱難梭菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法主要有厭氧培養(yǎng)法、毒素的免疫法檢測和基于相關(guān)毒素基因的分子檢測。Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)(XpertC.difficileAssay)是基于熒光定量PCR技術(shù)的一站式糞便標(biāo)本快速檢測技術(shù)，能同時檢測tcdB、二元毒素(binary toxin,cdtA和cdtB)和缺失ntΔ117的tcdC3種基因，且可以推測菌株是否為027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株。國外研究認(rèn)為其可以快速直接檢測糞便標(biāo)本中的產(chǎn)毒艱難梭菌，具有高敏感性和高特異性[3-4]。國內(nèi)少數(shù)實(shí)驗(yàn)室近年來也陸續(xù)引入Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)，其中瑞金醫(yī)院微生物室還與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行了比較研究，但沒有與產(chǎn)毒培養(yǎng)法進(jìn)行比較和評估，也未評估其檢測027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株的性能[5]。本研究以產(chǎn)毒培養(yǎng)(toxigenic culture)法為參比方法，評估Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的敏感性和特異性，并以027/NAP1/BI標(biāo)準(zhǔn)菌株的模擬糞便標(biāo)本驗(yàn)證其預(yù)測027型高產(chǎn)毒力菌株的能力，同時還分析比較了Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)與現(xiàn)有檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集 收集2016年3月至7月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院患者腹瀉糞便標(biāo)本43份，包括32份凍存標(biāo)本和11份新鮮標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)室自配ATCC BAA-1870(核糖體分型為027型)標(biāo)準(zhǔn)菌株(廣州醫(yī)科大學(xué)吳愛武教授惠贈)的菌液及模擬糞便標(biāo)本。

1.2 主要儀器與試劑 GeneXpert熒光定量檢測系統(tǒng)和XpertC.difficile檢測試劑盒(美國Cepheid公司)；哥倫比亞血平板、GENbag厭氧產(chǎn)氣袋、梅里埃Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、ANC卡、VIDAS全自動免疫分析儀和艱難梭菌毒素A/B(CDAB)檢測試劑盒(法國生物梅里埃公司)；2720型基因擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)；GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)；2×PCR Master Mix、RNA-free water(TaKaRa公司)；PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 Xpert艱難梭菌檢測 嚴(yán)格按照艱難梭菌檢測試劑盒說明書進(jìn)行稀便標(biāo)本的前處理，然后按照GeneXpert儀器操作說明書進(jìn)行熒光定量PCR，檢測標(biāo)本中艱難梭菌的tcdB、二元毒素和缺失型tcdC基因。臨床樣本及模擬糞便樣本的檢測均按照以上流程進(jìn)行。模擬糞便標(biāo)本制備：挑取黃豆大小正常糞便標(biāo)本于1.5 mL EP管中，加1 mL生理鹽水稀釋，用10 μL接種環(huán)挑取0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?27型標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液于糞便稀釋液中(約相當(dāng)于106菌量)，震蕩混勻，制成模擬糞便標(biāo)本。

1.4 艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)法 根據(jù)美國醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(SHEA)和美國感染病學(xué)會(IDSA)指南[6]，選擇艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)作為Xpert方法評估的金標(biāo)準(zhǔn)，艱難梭菌培養(yǎng)陽性并且其tcdA和(或)tcdB基因陽性定義為產(chǎn)毒培養(yǎng)陽性。培養(yǎng)時將收集的稀便標(biāo)本接種2塊哥倫比亞血瓊脂平板，其中一塊平板和厭氧指示劑同時放入?yún)捬醮鼉?nèi)，置于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h；另一塊直接置于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。細(xì)菌鑒定采用生物梅里埃公司的Vitek 2 Compact儀器和配套的ANC厭氧菌鑒定卡，并按說明書進(jìn)行操作。菌株的毒素基因鑒定采用實(shí)驗(yàn)室自建tcdA和tcdB基因PCR檢測技術(shù)[7]。

1.5 A/B毒素酶聯(lián)熒光免疫檢測 采用生物梅里埃公司的VIDAS系統(tǒng)和CDAB試劑盒，并按說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以產(chǎn)毒培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，用SPSS 21軟件計(jì)算敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。并將Xpert艱難梭菌檢測結(jié)果與產(chǎn)毒培養(yǎng)法、VIDAS檢測A/B毒素法檢測結(jié)果分別作一致性檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法比較 43例標(biāo)本共分離培養(yǎng)艱難梭菌11株，且產(chǎn)毒培養(yǎng)法鑒定均為A/B毒素基因雙陽性產(chǎn)毒株，其余32例培養(yǎng)陰性。Xpert艱難梭菌檢測法結(jié)果為12例陽性，31例陰性，未發(fā)現(xiàn)027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株，見表1。以產(chǎn)毒培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert艱難梭菌檢測法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為90.9%、93.8%、83.3%和96.8%。Xpert艱難梭菌檢測法和產(chǎn)毒培養(yǎng)法比較，一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.822(P<0.05)。

表1 Xpert艱難梭菌檢測法結(jié)果

43例標(biāo)本經(jīng)VIDAS系統(tǒng)CDAB試劑盒定量檢測艱難梭菌A/B毒素，結(jié)果4例陽性，39例陰性，和Xpert艱難梭菌檢測法比較，一致性檢驗(yàn)結(jié)果為Kappa值為0.419(P<0.05)，見表2。

表2 Xpert艱難梭菌檢測法與VIDAS系統(tǒng)CDAB檢測法一致性檢驗(yàn)

Xpert艱難梭菌檢測法VIDAS系統(tǒng)A/B毒素法陽性陰性總數(shù)陽性4812陰性03131總數(shù)43943

2.2 模擬糞便標(biāo)本檢測結(jié)果 Xpert檢測系統(tǒng)檢測實(shí)驗(yàn)室自配ATCC BAA-1870模擬糞便標(biāo)本，報(bào)告結(jié)果為tcdB、tcdC和Binary Toxin基因陽性，統(tǒng)計(jì)過程控制(statistical process control, SPC)顯示在控，并預(yù)測該菌株為027型高產(chǎn)毒力菌株，見圖1。

圖1 Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)鑒定027型艱難梭菌的陽性曲線

3 討論

艱難梭菌是院內(nèi)感染性腹瀉最常見的病原菌，快速檢測是臨床診治和感染控制的關(guān)鍵。盡管產(chǎn)毒培養(yǎng)法敏感性和特異性都很高，但厭氧培養(yǎng)和細(xì)菌鑒定設(shè)備和技術(shù)要求高，且報(bào)告周期長(48～72 h)，臨床推廣使用困難[1]。本研究所評價(jià)的Xpert艱難梭菌商品化檢測系統(tǒng)直接檢測臨床糞便標(biāo)本，除5 min左右的樣本前處理操作外，其余檢測均一站式解決，耗時只需要45 min。研究結(jié)果顯示，Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)和產(chǎn)毒培養(yǎng)法比較的敏感性和特異性均高于90%，2種方法存在較高的一致性，與國外研究結(jié)果一致[3-4]。當(dāng)與VIDAS免疫法毒素檢測系統(tǒng)比較時，2種方法的結(jié)果一致性差(Kappa=0.419)，這與免疫法檢測A/B毒素的敏感性和特異性顯著低于毒素基因的分子檢測技術(shù)有關(guān)。因此建議免疫法檢測艱難梭菌A/B毒素應(yīng)和高敏感性谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)試驗(yàn)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)毒素定量檢測的同時，降低毒素免疫學(xué)檢測的假陰性[8]。本研究通過模擬標(biāo)本驗(yàn)證了Xpert艱難梭菌系統(tǒng)檢測027型高產(chǎn)毒株的性能，該性能有助于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)監(jiān)測027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒株，提升醫(yī)院感染控制和預(yù)防高產(chǎn)毒株暴發(fā)流行的能力[4,9]。

本研究標(biāo)本量偏少，11例陽性分離株均為產(chǎn)毒株，未分離到非產(chǎn)毒株，對于評價(jià)Xpert艱難梭菌系統(tǒng)在產(chǎn)毒株鑒別方面尚存不足。而臨床不產(chǎn)毒艱難梭菌在成人和兒童腸道定植菌中均有存在，有報(bào)道2歲以下兒童不產(chǎn)毒艱難梭菌定植率高達(dá)26.5%[10]。Xpert艱難梭菌系統(tǒng)主要通過檢測tcdB

基因來診斷產(chǎn)毒艱難梭菌感染，臨床產(chǎn)毒株的毒素基因型絕大部分是tcdA+tcdB+型，少數(shù)表現(xiàn)為tcdA-tcdB+，尚未發(fā)現(xiàn)tcdA+tcdB-型艱難梭菌。因此，Xpert艱難梭菌系統(tǒng)的檢測模式符合臨床需求，可以用于臨床艱難梭菌感染的快速診斷，且可以預(yù)警027型高產(chǎn)毒株的流行。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Clinical application evaluation of Xpert detection system ofClostridiumdifficile

HUANGXu,LIUCheng-cheng,XUTing,TANGChen-jie,XIAWen-ying,NIFang,WANGFang,LIUGen-yan

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To evaluate the clinical application value of Xpert detection system ofClostridiumdifficile(C.difficile). Methods A total of 43 stool specimens from the patients with diarrhea were collected, andC.difficilein stool specimens were detected by the Xpert detection system, the toxigenic culture method, and the toxin detection method which detected the toxin ofC.difficileby VIDAS automatic analyzer after anaerobic culture, respectively. The analytic performance of Xpert detection system was evaluted based on the toxigenic culture method as the gold standard. Meanwhile, the consistency of the results from different detection methods was compared. The ribotype 027 strain (ATCC BAA-1870) simulating the stool specimen was further used to verify the Xpert detection system. Results Based on the gold standard of the toxigenic culture method, the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the Xpert detection system were 90.9%, 93.8%, 83.3% and 96.8%, respectively. The Kappa values for the consistency between the Xpert detection system and the toxigenic culture method or the toxin detection method were 0.822 (P<0.05) and 0.419 (P<0.05), respectively. Moreover, the ribotype 027 strain simulating the stool specimen was verified by the Xpert detection system successfully. Conclusion The Xpert detection system may rapidly and accurately detect theC.difficilein stool specimens, especially the ribotype 027 strain with high toxicity.

Clostridiumdifficile; Xpert detection system ofClostridiumdifficile; toxigenic culture

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.09

江蘇省“興衛(wèi)工程”實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(XK201114);衛(wèi)生部腸道病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(EM201401)。

黃旭，1991年生，女，碩士研究生，主要從事臨床微生物的分子診斷研究。

劉根焰，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：liugenyan@njmu.edu.cn。

R446.5

A

2016-11-31)